內(nèi)皮細(xì)胞與單核-巨噬細(xì)胞的相互作用對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及通絡(luò)干預(yù)研究.pdf

1、目的：氧化低密度脂蛋白等多種致病因素均可造成血管內(nèi)皮損傷，受損內(nèi)皮細(xì)胞釋放趨化粘附分子促進(jìn)單核細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下層成為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后成為泡沫細(xì)胞，并進(jìn)一步形成粥樣斑塊；其中M1型巨噬細(xì)胞又可釋放炎癥因子而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞損傷與巨噬細(xì)胞浸潤形成惡性循環(huán)，加重動(dòng)脈管壁病變及斑塊的不穩(wěn)定性。因此內(nèi)皮細(xì)胞損傷與單核/巨噬細(xì)胞的相互作用對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及增加斑塊不穩(wěn)定性具有重要意義。本研究采用離體實(shí)驗(yàn)觀察通心絡(luò)及人參皂苷R

2、b1對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附及M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，為通心絡(luò)臨床防治動(dòng)脈粥樣硬化提供實(shí)驗(yàn)支撐。
　　方法：⑴實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、通心絡(luò)組（TXL）、人參皂苷Rb1組（Rb1），采用ox-LDL損傷HUVECs造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型并給予通心絡(luò)和人參皂苷 Rb1進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞生存活性、線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化及LOX-1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3、，以觀察通心絡(luò)和人參皂苷Rb1對(duì)ox-LDL損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的影響。采用共培養(yǎng)的方式觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中趨化粘附分子的表達(dá)及單核細(xì)胞上相應(yīng)受體的表達(dá)，以觀察通心絡(luò)和人參皂苷Rb1對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的影響。⑵實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（Control）、PMA對(duì)照組（PMA）、M2組、M1組、TXL組、Rb1組。采用PMA分別聯(lián)合IL-4、LPS建立巨噬細(xì)胞極化模型并給予通心絡(luò)和人參皂苷 Rb1進(jìn)行干預(yù)

4、，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子的水平及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),以觀察通心絡(luò)和人參皂苷Rb1對(duì)巨噬細(xì)胞向M1型極化的影響。采用共培養(yǎng)的方式觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程及凋亡相關(guān)蛋白 caspase3、bax、bcl-2的表達(dá)，以觀察通心絡(luò)和人參皂苷Rb1對(duì)M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：①與正常對(duì)照組比較，ox-LDL可顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞生存活性，通心絡(luò)(TXL)、人參皂苷Rb1(Rb1)可

5、提高ox-LDL損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的生存活性。②采用活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位變化，綠色熒光標(biāo)記線粒體，紅色熒光標(biāo)記線粒體膜上電勢(shì)較高位置。正常對(duì)照組紅色熒光持續(xù)存在，模型組紅色熒光較快減弱消失，TXL和Rb1組紅色熒光減弱發(fā)生較晚、程度較輕。表示TXL和Rb1可延緩并減輕ox-LDL引起的線粒體膜電位下降。③采用活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子變化，綠色熒光標(biāo)記鈣離子。正常對(duì)照組綠色熒光持續(xù)存在于細(xì)胞周邊部位，細(xì)胞內(nèi)綠

6、色熒光分布較少，模型組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光分布較廣、程度較強(qiáng)，TXL和Rb1組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光分布明顯比模型組少，與正常對(duì)照組分布相似。表示通絡(luò)干預(yù)能夠抑制ox-LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流。④Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組HUVEC細(xì)胞LOX-1、p38MAPK、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白表達(dá)增多，IκBα蛋白表達(dá)減少；與模型組比較， TXL和Rb1組HUVEC細(xì)胞LOX-1、p38MA

7、PK、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白的表達(dá)減少，IκBα蛋白表達(dá)增加。表示ox-LDL能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1的表達(dá)及NF-κB信號(hào)通路的活化，TXL和Rb1能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1的表達(dá)，減少IκBα的降解并抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。細(xì)胞免疫熒光方法觀察NF-κBp65核轉(zhuǎn)位的結(jié)果也表明TXL和Rb1能夠抑制ox-LDL引起的NF-κB信號(hào)通路活化。⑤采用共培養(yǎng)及活細(xì)胞染色的方法觀察內(nèi)皮細(xì)

8、胞與單核細(xì)胞的粘附，用hoechst-33342細(xì)胞核藍(lán)色染料對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞染色。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的單核細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與模型組比較，TXL和Rb1組粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的單核細(xì)胞數(shù)量明顯減少。表明TXL和Rb1能抑制受損內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附。⑥ELISA結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1的水平升高，與模型組比較，TXL和Rb1組內(nèi)皮細(xì)胞培

9、養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1的水平顯著降低。表示TXL和Rb1能夠抑制ox-LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞趨化粘附分子的表達(dá)。⑦qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組THP-1細(xì)胞CCR2、Mac-1、VLA4 mRNA表達(dá)升高，與模型組比較，TXL和Rb1組THP-1細(xì)胞CCR2、Mac-1、VLA4 mRNA表達(dá)降低。Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組THP-1細(xì)胞CCR2、Mac-1、

10、VLA4蛋白表達(dá)升高；與模型組比較，TXL和Rb1組THP-1細(xì)胞CCR2、Mac-1、VLA4蛋白表達(dá)降低。以上結(jié)果表明，TXL和Rb1能夠抑制受損內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的CCR2、Mac-1、VLA4的表達(dá)。⑧與正常對(duì)照組比較，PMA組IL-10、IL-6、TNF-α的水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明實(shí)驗(yàn)濃度的PMA對(duì)巨噬細(xì)胞極化表型沒有影響。與正常對(duì)照組比較， M2組IL-10水平升高，IL-6、TNF-α的水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與正常對(duì)照組和

11、M2組比較，M1組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10水平明顯降低，IL-6、TNF-α水平明顯升高，說明M2和M1型巨噬細(xì)胞模型建立成功。與M1組比較， TXL和Rb1組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10的水平升高，IL-6、TNF-α的水平下降，說明TXL和Rb1可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1型極化。⑨Western blot結(jié)果顯示，正常對(duì)照組與PMA組比較，Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，

12、表明實(shí)驗(yàn)濃度的PMA沒有對(duì)Notch信號(hào)通路產(chǎn)生影響。與正常對(duì)照組和M2組比較， M1組Notch-1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達(dá)明顯升高；與M1組比較，TXL和Rb1組active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果表明，TXL和Rb1可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Notch信號(hào)通路的活化。⑩采用共培養(yǎng)方式以活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程。

13、結(jié)果顯示，正常對(duì)照組HUVEC細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，邊緣清晰，熒光強(qiáng)度彌散均一，可見細(xì)胞分裂增殖；PMA組和M2組HUVEC細(xì)胞核觀察初期與正常對(duì)照組無明顯差別，觀察后期可見細(xì)胞核固縮碎裂；M1組HUVEC細(xì)胞核較早出現(xiàn)濃染、固縮、邊緣化，細(xì)胞核體積縮小，核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體。TXL組和Rb1組HUVEC細(xì)胞核形態(tài)較M1組規(guī)整，邊緣較清晰，核濃染、固縮、邊緣化等現(xiàn)象發(fā)生較晚，程度較輕，并可見細(xì)胞分裂增殖。
　　結(jié)論：⑴通心絡(luò)和人參皂苷R

14、b1可以抑制ox-LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1/NF-κB信號(hào)通路的活化，部分阻止線粒體膜電位下降和鈣離子內(nèi)流，起到改善受損內(nèi)皮細(xì)胞功能，減少趨化、粘附分子表達(dá)的作用。并進(jìn)一步減少由于內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的單核細(xì)胞粘附及單核細(xì)胞趨化粘附分子受體的表達(dá)。⑵通心絡(luò)和人參皂苷Rb1可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Notch信號(hào)通路活化，部分阻止巨噬細(xì)胞向 M1型極化，減少炎癥因子表達(dá)，減輕M1型巨噬細(xì)胞引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。⑶通心絡(luò)和人參皂苷 Rb1