巨噬細(xì)胞表達(dá)的swiprosiN-1在動脈粥樣硬化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是累及大、中動脈內(nèi)膜的慢性進(jìn)展性炎癥疾病，常造成冠心病、腦卒中等缺血性心血管疾病。動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。巨噬細(xì)胞是斑塊中重要組成部分，目前研究認(rèn)為巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化起始、發(fā)展的全過程中發(fā)揮著重要作用，巨噬細(xì)胞與動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)生的細(xì)胞凋亡、自噬以及炎癥反應(yīng)等均有密切的關(guān)系。
　　Swiprosin-1是一種新型蛋白，在2004年由瑞士科

2、研人員Vuadens F等首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，后續(xù)相關(guān)報(bào)道主要圍繞其在淋巴細(xì)胞中的作用及其他免疫相關(guān)功能的研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)swiprosin-1表達(dá)在主動脈斑塊中，而且發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)在斑塊的巨噬細(xì)胞中。目前未見swiprosin-1在動脈粥樣硬化中作用的相關(guān)報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1后巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯減弱，由于巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變是動脈粥樣硬化發(fā)病的生理基礎(chǔ)，對動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的調(diào)節(jié)具有重要作用，

3、因此，我們推測巨噬細(xì)胞表達(dá)的swiprosin-1在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本課題圍繞巨噬細(xì)胞swiprosin-1在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用展開研究，并初步探討其機(jī)制，從而為動脈粥樣硬化的治療提供新靶點(diǎn)。
　　方法與結(jié)果:
　　一、Swiprosin-1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)及定位
　　1.應(yīng)用組織切片和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記swiprosin-1以及巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)swiprosin-1在斑塊

4、中有表達(dá)，且與巨噬細(xì)胞特異標(biāo)記物F4/80共定位。
　　2.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記巨噬細(xì)胞中的swiprosin-1，免疫印跡技術(shù)檢測swiprosin-1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)swiprosin-1主要分布在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜上，核中無表達(dá)，且在巨噬細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平很高。
　　3.應(yīng)用免疫印跡方法檢測主動脈中內(nèi)皮層、平滑肌層中swiprosin-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)主動脈內(nèi)皮層和平滑肌層均無swiprosin-1表達(dá)

5、。
　　二、Swiprosin-1在動脈粥樣硬化整體斑塊中的表達(dá)變化
　　1.給予ApoE-/-小鼠高脂飼養(yǎng)，構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型，取其主動脈進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察到動脈壁斑塊形成，證明整體造模成功。
　　2.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)對模型組與對照組主動脈中swiprosin-1含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，動脈粥樣硬化組小鼠主動脈中swiprosin-1蛋白表達(dá)水平增加。
　　三、Swiprosin-1在巨噬

6、細(xì)胞泡沫化中的表達(dá)變化
　　1.Ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后油紅染色，構(gòu)建巨噬細(xì)胞泡沫化模型，發(fā)現(xiàn)隨著Ox-LDL的濃度由10μg/mL增加到80μg/mL，巨噬細(xì)胞泡沫化程度加深。
　　2.免疫印跡技術(shù)檢測不同濃度Ox-LDL(10，20，40，80μg/mL)刺激RAW264.7細(xì)胞檢測對swiprosin-1表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度的加大，swiprosin-1表達(dá)水平上升，在40μg/mL達(dá)到峰

7、值。
　　3.免疫印跡技術(shù)檢測Ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)長(0，6，12，24，48 h)對于swiprosin-1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示隨著刺激時(shí)間的延長，swiprosin-1表達(dá)水平上升，在24h達(dá)到最高。
　　4.提取小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，Ox-LDL刺激，進(jìn)行驗(yàn)證，免疫印跡結(jié)果顯示swiprosin-1在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中表達(dá)增多。
　　四、敲除swiprosin-1對于動脈粥樣硬化發(fā)展的影響

8、
　　將swiprosin-1-/-以及swiprosin-1+/+小鼠骨髓移植入ApoE-/-小鼠體內(nèi)，前者為模型組，后者為對照組，然后飼以高脂飼料4個(gè)月，構(gòu)建動脈粥樣硬化模型。
　　1.將模型組與對照組小鼠剝離主動脈縱向剖開，應(yīng)用油紅O染色法對主動脈斑塊進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)swiprosin-1敲除組斑塊明顯少于對照組。
　　2.應(yīng)用冰凍切片技術(shù)橫切主動脈組織，油紅O染色法對主動脈切片進(jìn)行染色，結(jié)果同樣顯示swipros

9、in-1敲除組斑塊面積較對照組小。
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲除swiprosin-1小鼠動脈粥樣硬化造模之后，斑塊中巨噬細(xì)胞含量減少。
　　4.取模型小鼠血清進(jìn)行血脂檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲除swiprosin-1之后，小鼠血清中膽固醇含量降低。
　　五、敲除swiprosin-1對于巨噬細(xì)胞泡沫化的影響
　　分別從swiprosin-1-/-以及swip

10、rosin-1+/+小鼠中提取原代腹腔巨噬細(xì)胞，前者作為模型組，后者為對照組。
　　1.Ox-LDL刺激造模，應(yīng)用油紅O染色，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲除swiprosin-1的巨噬細(xì)胞泡沫化程度降低。
　　2.Ox-LDL刺激造模，進(jìn)行膽固醇檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲除swiprosin-1的巨噬細(xì)胞膽固醇含量降低。
　　3.利用熒光標(biāo)記檢測膽固醇流出，結(jié)果顯示過表達(dá)swiprosin-1之后，巨噬細(xì)胞膽固醇流出減少。

11、r>　　4.檢測巨噬細(xì)胞對熒光標(biāo)記氧化型低密度脂蛋白的吞噬，發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)功能增強(qiáng)。
　　六、Swiprosin-1影響動脈粥樣硬化發(fā)展可能的機(jī)制
　　分別從swiprosin-1-/-以及swiprosin-1+/+小鼠中提取原代腹腔巨噬細(xì)胞，前者作為模型組，后者為對照組。
　　1.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示敲除swiprosin-1之后，促凋亡相

12、關(guān)蛋白Bax、caspase3、caspase9含量減少，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加。進(jìn)而采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒以及TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果均顯示敲除swiprosin-1之后，巨噬細(xì)胞凋亡顯著減少(7.93±1.52％ vs0.41±0.12％)。
　　2.利用Elisa試劑盒檢測血清以及巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子的含量，發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后，炎癥因子IL-1β、TNF-α

13、水平均出現(xiàn)降低。
　　3.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后，巨噬細(xì)胞LC3表達(dá)上升，P62表達(dá)下降，提示巨噬細(xì)胞自噬功能可能增強(qiáng)。
　　4.應(yīng)用Transwell遷移技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞遷移能力，發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后，巨噬細(xì)胞遷移能力下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.Swiprosin-1在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，且隨著泡沫化程度加重而表達(dá)增加;