Tim-3調控單核-巨噬細胞和NK細胞參與動脈粥樣硬化的研究.pdf

1、冠心病是發(fā)達國家首位致死性病因,在我國的發(fā)病率和致死率也逐年升高。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)占冠狀動脈性心臟病的絕大多數(shù)(95％-99％),而動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動脈急性狹窄和閉塞是導致急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)的重要因為。目前研究認為動脈粥樣硬化是一種多病因的慢性炎癥性疾病,局部和全身的炎癥免疫反應在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)

2、展過程中起著重要作用,固有免疫和適應性免疫共同參與調節(jié)動脈粥樣硬化病變。動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細胞,其中以巨噬細胞和T細胞最為常見,此外還有少量的樹突狀細胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細胞(naturalkiller cell,NK cell)和肥大細胞(mast cell)等,偶有B淋巴細胞。
　　 動脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結果,目前已發(fā)現(xiàn)的動脈粥樣硬化危險性因素很多,但相關針對治療及

3、控制效果均不理想,降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。越來越多的證據(jù)顯示免疫反應參與動脈粥樣硬化發(fā)展的各個環(huán)節(jié)。免疫缺陷小鼠與正常小鼠相比,動脈粥樣硬化的嚴重程度減輕約70％；而血清膽固醇水平?jīng)]有改變。因此炎癥免疫調節(jié)機制成為目前研究的熱點,對該機制的研究將為動脈粥樣硬化的治療開辟新的道路。
　　 T細胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing

4、molecule-3,Tim-3)是2002年發(fā)現(xiàn)的新型免疫調節(jié)分子,選擇性表達在分化終末期的Th1細胞上。Tim-3與其配體galectin-9結合后負向調控Th1細胞功能,并誘導Th1細胞凋亡,介導免疫耐受的形成。大量研究報道Tim-3通過調節(jié)適應性免疫反應在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在多種固有免疫細胞,包括NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞上均有表達,但Tim-3達,而在單核細胞和NK細胞上高水平表達。且冠

5、心病患者單核和NK細胞上Tim-3表達水平顯著高于健康志愿者(單核細胞,p<0.0001；NK細胞,p=0.0005),但冠心病患者CD4+和CD8+T細胞上Tim-3的表達同健康志愿者無顯著性差異。
　　 動脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結果,臨床資料分析結果顯示單核細胞上Tim-3表達水平同多種致病因素呈現(xiàn)良好的相關性,包括甘油三酯(P=0.0320)和收縮壓(p=0.0016)等,NK細胞上Tim-3表達水平也同甘油三

6、酯(p=0.0121)和膽固醇(p=0.0220)正相關。
　　 2.動脈粥樣硬化患者Tim-3表達與炎癥水平密切相關
　　 ELISA檢測結果顯示AS患者血清學炎癥指標包括腫瘤壞死因子α(tumernecrosis factor-α,TNF-α)和C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)較健康對照顯著升高(CRP,p=0.0237；TNF-α,p=0.0235)。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)單核細胞和NK細胞上T

7、im-3的表達水平與TNF-α及CRP正相關,提示Tim-3與AS病人體內炎癥水平相關。與此相符,分析顯示炎癥水平較高的患者其單核細胞和NK細胞上Tim-3表達水平也相應較高,說明Tim-3同動脈粥樣硬化患者炎癥水平密切相關,可能參與動脈粥樣硬化患者炎癥過程。
　　 以上研究結果提示,Tim-3參與動脈粥樣硬化病變,可能主要通過調控NK細胞和巨噬細胞發(fā)揮作用。
　　 第二部分Tim-3對單核/巨噬細胞的調控及其在動脈粥樣

8、硬化中作用
　　 單核/巨噬細胞是AS的重要效應細胞。單核細胞遷移至血管內膜以及單核細胞源性巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白是動脈粥樣硬化的關鍵性起始因素。臨床研究顯示AS患者外周血單核細胞Tim-3表達顯著升高,且與多種致病因素相關,強烈提示單核/巨噬細胞表達的Tim-3參與AS發(fā)生。有研究顯示Tim-3組成性表達于單核/巨噬細胞,促進巨噬細胞炎性反應。然而Tim-3是否參與AS發(fā)生中單核/巨噬細胞介導的炎癥反應,Tim-3影響單

9、核/巨噬細胞的哪種效應,目前尚未見報道。為了研究Tim-3對動脈粥樣硬化單核/巨噬細胞的調控作用,本研究利用小鼠單核/巨噬細胞系RAW264.7和AS患者外周血單核細胞進行了一系列體外研究。
　　 1.LPS/ox-LDL活化的鼠單榭巨噬細胞系RAW264.7中Tim-3表達顯著升高
　　 炎癥介質脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以有效活化巨噬細胞,而氧化低密度脂蛋白(oxidized-low d

10、ensity lipoprotein,ox-LDL)是介導巨噬細胞泡沫化的重要致動脈粥樣硬化因子。免疫組化和實時定量PCR結果顯示,LPS和ox-LDL刺激都能夠顯著上調小鼠單核/巨噬細胞系RAW264.7中Tim-3的表達,而LPS誘導效果較OX-LDL更為強烈,約為ox-LDL誘導效果的兩倍。
　　 2.Tim-3對單核/巨噬細胞功能的調控作用
　　 外周血中的單核細胞釋放一氧化氮(nitric oxide,NO)參

11、與血管舒張和重構等,在動脈粥樣硬化中起到積極的保護作用。但斑塊中單核細胞來源的巨噬細胞吞噬斑塊中的脂質成為荷脂細胞后,釋放大量促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6等介導斑塊局部的炎癥反應,促進斑塊形成和破裂。
　　 結果提示,Tim-3的確能夠有效抑制LPS/ox-LDL誘導的單核/巨噬細胞NO的分泌。
　　 3.Tim-3調控單核/巨噬細胞的信號通路
　　 為了研究Tim-3調控單核/巨噬細胞功能的分子機制,

12、本研究利用阻斷性抗體阻斷Tim-3信號后,western blot檢測LPS刺激的RAW264.7細胞中NF-κB(nuclear factor-kappa B)通路和MAPK(Mitogen-activatcd protein kinase)通路中的關鍵分子。
　　 第三部分Tim-3對NK細胞的調控及其在動脈粥樣硬化中作用
　　 動物實驗及臨床檢測證明NK細胞存在于斑塊形成的各個時期,提示NK細胞在AS發(fā)生中的作用。

13、多篇文獻報道在AS患者外周血中NK細胞的活性和數(shù)量顯著下降,然而其機制尚未闡明。已有研究發(fā)現(xiàn)Tim-3與其配體結合可以介導Th1細胞凋亡,抑制Th1應答,同時文獻證實,Tim-3組成性高表達于NK細胞,但Tim-3對NK功能的影響迄今尚未見報道。本課題第一部分臨床研究發(fā)現(xiàn),AS患者外周血NK細胞Tim-3表達顯著升高。為了研究Tim-3對NK細胞的調控作用,本部分利用人NK92細胞系和純化的人外周血NK細胞,體外研究Tim-3過表達或T

14、im-3阻斷對NK細胞活性和數(shù)量的影響。
　　 1.Tim-3抑制NK細胞活性
　　 冠心病患病危險度與病原感染相關,而且存在多重感染是冠心病患者發(fā)生心肌梗死的獨立危險因素。NK細胞是人體第一道防線,在對病原體,尤其是病毒的防御中起到重要作用。NK主要通過細胞毒作用和分泌細胞因子參與免疫反應。同時多篇文獻報道動脈粥樣硬化中NK細胞介導的殺傷導致血管細胞損傷,可能促進了斑塊的形成。因此NK細胞的殺傷功能對動脈粥樣硬化起到多

15、重影響。本研究用Tim-3融合蛋白阻斷NK92細胞Tim-3信號通路后,以肝癌細胞系HepG2和乙肝病毒感染的肝癌細胞系HepG2.2.15為靶細胞,分別按效靶比1:1,5:1,25:1共孵育,4小時后CCK-8檢測殺傷效率,研究Tim-3對NK殺傷功能的調控作用。結果顯示在效靶比5:1和25:1組,Tim-3阻斷后顯著上調NK細胞對靶細胞的殺傷活性,同時ELISA檢測顯示Tim-3阻斷后NK92細胞干擾素-γ(interferon-γ

16、,IFN-γ)分泌增加。說明NK細胞上表達上調的Tim-3可能抑制其殺傷活性和細胞因子的分泌。
　　 2.Tim-3對NK細胞數(shù)量的調節(jié)
　　 綜合上述結果,體外研究證實Tim-3能夠上調NK細胞殺傷活性,并通過抑制NK細胞增殖和促進NK細胞凋亡兩個途徑導致NK細胞數(shù)量的減少,這可能是AS患者外周循環(huán)中NK細胞活性降低和數(shù)量減少的重要機制。但是NK細胞在動脈粥樣硬化中的作用目前還不明確,多篇文獻認為NK細胞對病原體感染的

17、清除對動脈粥樣硬化起到保護性作用,但也有研究報道NK細胞介導的殺傷導致血管細胞損傷,同時NK細胞在不同的動物模型中對動脈粥樣硬化的影響結論不同,因此NK細胞在動脈粥樣硬化中的作用尚需進一步研究。
　　 第四部分Tim-3對ApoE-/-小鼠斑塊形成影響的體內研究
　　 綜上所述,本研究首次證實Tim.3在AS患者外周血單核/巨噬細胞和NK細胞上表達上調,并通過基因轉染和抗體阻斷技術,進一步研究了Tim-3對單核/巨噬細胞