紫花牡荊素靶向TGF-β-Smad信號(hào)通路減輕肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝纖維化是許多慢性肝臟疾病的共同病理基礎(chǔ)，主要以細(xì)胞外基質(zhì)（尤其是纖維膠原）的過度沉積為特征，是機(jī)體對各種病因引起慢性肝損傷后的一種損傷修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程。
　　在受損的肝臟中，活化的肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)是分泌纖維膠原的主要細(xì)胞。正常情況下，HSC處于靜息狀態(tài)，位于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與竇狀小管內(nèi)皮層細(xì)胞之間(Disse間隙)，主要功能是儲(chǔ)存維生素A，只產(chǎn)生少量的細(xì)胞外基質(zhì)組分用于基質(zhì)膜的形成。在

2、損傷因子的持續(xù)作用下，HSC轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，合成和分泌大量的纖維膠原，尤其是Ⅰ型及Ⅲ型膠原，此外還有大量基質(zhì)金屬蛋白酶，如MMP-2、MMP-9等，以及它們的抑制劑TIMPs。
　　大量研究表明，許多天然化合物具有保肝作用。蔓荊子是我國傳統(tǒng)中草藥的一種，其成熟的果實(shí)常被用作治療頭痛、感冒、偏頭痛和目赤腫痛。紫花牡荊素，是從蔓荊子中提取的主要黃酮類化合物之一。其已被證實(shí)具有多種生物學(xué)活性，但大多數(shù)研究都集中于紫花

3、牡荊素在不同類型的癌癥中的抗腫瘤作用。近期研究表明，紫花牡荊素在體內(nèi)及體外均有抗炎作用。在小鼠中，紫花牡荊素可以改善吸煙誘導(dǎo)的急性肺炎，可減少巴豆油所致耳皮炎和耳水腫。值得引起注意的是，最新的研究指出，紫花牡荊素在體外可以誘導(dǎo)HSC凋亡，且呈劑量和時(shí)間依賴性。然而，其在體內(nèi)對HSC的作用及其是否具有抗纖維化的效能卻尚未見報(bào)道。
　　目的:
　　本研究旨在通過構(gòu)建小鼠肝纖維化的體內(nèi)模型，探討紫花牡荊素對肝纖維化的治療作用及其作

4、用機(jī)理，以期將紫花牡荊素作為防治肝纖維化的藥物應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、我們將體重近似的同齡C57小鼠隨機(jī)分為4組:空白對照組(Control)、紫花牡荊素對照組(Casticin)、四氯化碳疾病組(CCl4)以及紫花牡荊素治療組(CCl4+Casticin)，以腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠肝纖維化模型，造模6周后再灌胃給予紫花牡荊素(20mg/kg)治療2周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)一取材，觀察分析。
　　

5、2、通過對各組小鼠血液進(jìn)行生化分析，對小鼠肝臟進(jìn)行HE染色、苦味酸-天狼星紅染色及肝組織膠原含量測定，檢測紫花牡荊素在體內(nèi)對小鼠肝纖維化的作用。
　　3、利用Western blot、免疫組化及Real-time PCR檢測紫花牡荊素對標(biāo)志HSC活化的相關(guān)分子——α-SMA、α1(Ⅰ)collagen、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2及TGF-β1等表達(dá)的影響，同時(shí)檢測TGF-β/Smad信號(hào)通路下游p-Smad

6、2(S465/467)和p-Smad3(S423/425)的蛋白表達(dá)水平。
　　4、利用人肝星狀細(xì)胞系——LX2細(xì)胞開展體外實(shí)驗(yàn)，通過CCK8及Westernblot檢測紫花牡荊素對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　5、使用TGF-β1刺激LX2細(xì)胞，通過免疫熒光、Real-time PCR及Western blot檢測一系列HSC活化標(biāo)志物的表達(dá)及紫花牡荊素的干預(yù)對這些標(biāo)志物的影響，同時(shí)檢測p-Smad2/3的表達(dá)，以明確和驗(yàn)證

7、紫花牡荊素在其中的潛在作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、紫花牡荊素改善了CCl4所致肝功能損傷及肝組織病變
　　本論文對紫花牡荊素的體內(nèi)研究采用了治療性給藥的方案，即在肝纖維化模型誘導(dǎo)成功后給予藥物治療以觀察藥物的效應(yīng)。首先，我們觀察了紫花牡荊素對CCl4所致肝臟纖維化的損傷是否具有改善作用。我們通過測定小鼠血清中ALT和AST水平來觀察紫花牡荊素對肝功能的影響。結(jié)果表明，紫花牡荊素的治療改善了CCl4引起的肝損傷，降低

8、了CCl4引起的小鼠血清ALT和AST的升高;而紫花牡荊素對照組二者水平與Control組相比無顯著變化，說明紫花牡荊素對正常的肝組織無損傷作用即無肝毒性。
　　以HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查顯示，正常小鼠的肝組織肝小葉完整，肝細(xì)胞排列整齊;而CCl4疾病組小鼠的肝組織可見大量發(fā)生脂肪變、炎性浸潤、氣球樣變、甚或壞死的肝細(xì)胞，且出現(xiàn)明顯纖維間隔，纖維結(jié)締組織以匯管區(qū)為中心明顯增生，逐漸向肝小葉內(nèi)延伸并包繞肝細(xì)胞，但尚未見明顯假小葉形

9、成。給予紫花牡荊素治療后，肝組織的病變得到明顯改善。組織學(xué)病理評(píng)分顯示，紫花牡荊素的治療減輕了CCl4引起的肝組織的炎癥及纖維化程度，纖維化病理評(píng)分與CCl4疾病組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001);同樣，紫花牡荊素對照組與Control組相比無顯著變化。
　　2、紫花牡荊素減輕了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化
　　接下來，我們對各組小鼠的肝組織樣本進(jìn)行狼紅染色，檢測肝組織膠原沉積情況。我們發(fā)現(xiàn)，CCl4疾病組小鼠的肝臟膠原纖維較

10、Control組小鼠顯著增多，匯管區(qū)周圍及小葉間動(dòng)、靜脈壁均可見明顯膠原染色，而給予紫花牡荊素治療可以有效地減少肝組織中的膠原沉積及纖維間隔的形成。我們將各組小鼠的肝組織狼紅染色切片在10X鏡下拍照，每個(gè)樣品隨機(jī)選取3個(gè)100X的視野，在Image pro-plus軟件中進(jìn)行圖像分析，對各組樣品間代表膠原的紅色區(qū)域進(jìn)行檢測比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:紫花牡荊素治療組肝組織的膠原含量低于CCl4疾病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。此外，我

11、們還對各組小鼠肝組織中的羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果表明，紫花牡荊素降低了肝纖維化小鼠肝組織中的HYP水平，和上述狼紅染色結(jié)果吻合，進(jìn)一步表明了紫花牡荊素可以抑制膠原的生成，減輕肝纖維化。
　　3、紫花牡荊素減輕肝纖維化的機(jī)制可能是通過抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，減少HSC活化實(shí)現(xiàn)的。
　　為了明確紫花牡荊素減輕肝纖維化的作用機(jī)制，我們對HSC的活化情況進(jìn)行了考察。首先以免疫

12、印跡法檢測了肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA及vimentin在肝組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，纖維化小鼠肝臟中二者均顯著高表達(dá)，提示纖維化肝臟中的HSC大量活化;而給予紫花牡荊素干預(yù)后，上述HSC活化指標(biāo)均表達(dá)下降，提示紫花牡荊素對HSC的活化具有抑制作用。對各組肝組織樣品進(jìn)行α-SMA的免疫組化染色亦得到了同樣的結(jié)論。為進(jìn)一步確證紫花牡荊素抑制了HSC的活化，我們用Real-time PCR檢測了MMP-2、MMP-9、T

13、IMP-1、TIMP-2及TGF-β1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:紫花牡荊素在mRNA水平降低了纖維化肝臟中顯著增加的以上HSC活化相關(guān)分子的含量。而其中，值得特別關(guān)注的是，TGF-β1的表達(dá)在纖維化肝臟中顯著增高，但可被紫花牡荊素的干預(yù)降低。這一現(xiàn)象提示我們，紫花牡荊素可能通過減少TGF-β1的表達(dá)抑制HSC的活化。因此，我們接下來進(jìn)一步對TGF-β1啟動(dòng)的TGF-β/Smad信號(hào)通路進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，與CCl4疾病組相比，紫花

14、牡荊素的治療可下調(diào)p-Smad3(S423/425)的表達(dá)水平。
　　4、紫花牡荊素抑制LX2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡
　　為了進(jìn)一步探討和驗(yàn)證紫花牡荊素抗纖維化的作用機(jī)制，我們利用LX2細(xì)胞開展了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示，LX2細(xì)胞的增殖明顯被紫花牡荊素抑制，且呈劑量依賴性。此外，我們檢測了紫花牡荊素對LX2細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)。我們通過免疫印跡檢測細(xì)胞cleaved PARP的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示:未處理的LX2細(xì)胞

15、幾乎不表達(dá)cleaved PARP，而經(jīng)紫花牡荊素干預(yù)的LX2細(xì)胞，其cleaved PARP的表達(dá)增多，且呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴性。以上研究結(jié)果表明:紫花牡荊素抑制LX2細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)其凋亡。
　　5、紫花牡荊素通過靶向TGF-β/Smad信號(hào)來抑制LX2細(xì)胞活化及膠原基質(zhì)的表達(dá)
　　接下來，我們檢測了紫花牡荊素是否能夠抑制LX2細(xì)胞的活化。對LX2細(xì)胞進(jìn)行α-SMA蛋白的免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何處理的LX2細(xì)胞呈

16、現(xiàn)自然伸展的星形，予TGF-β1刺激后，α-SMA蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而給予紫花牡荊素處理后，細(xì)胞觸角消失，形態(tài)偏圓，α-SMA蛋白的表達(dá)顯著減弱。我們提取各組細(xì)胞的RNA進(jìn)行了Real-time PCR，對α-SMA、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2及TGF-β1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，得到的結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即紫花牡荊素在mRNA水平降低了LX2細(xì)胞中代表其活化水平的相關(guān)分子含量。
　　然而，紫花牡荊

17、素是通過怎樣的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響HSC?為了驗(yàn)證我們在肝纖維化小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得出的推論，我們檢測了TGF-β/Smad信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子p-Smad2/3的蛋白水平。免疫印跡結(jié)果顯示:予TGF-β1刺激后的LX2細(xì)胞，其p-Smad2/3的表達(dá)明顯上調(diào)，而紫花牡荊素的干預(yù)可明顯減少p-Smad2/3的表達(dá)（圖1-17）。這一結(jié)果表明，紫花牡荊素通過靶向TGF-β/Smad信號(hào)來抑制HSC活化，減少膠原基質(zhì)的表達(dá)。
　　結(jié)論:<

18、br>　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，紫花牡荊素可改善CCl4所致肝功能損傷及肝組織病變，能夠減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化，其抗肝纖維化的作用機(jī)制可能是通過抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，從而減少HSC的活化實(shí)現(xiàn)的。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)表明，紫花牡荊素能抑制LX2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且能通過靶向TGF-β/Smad信號(hào)抑制LX2細(xì)胞活化，減少膠原基質(zhì)的表達(dá)。
　　3、我們的研究表明，紫花牡荊素具有護(hù)肝、抗纖維化、化學(xué)預(yù)防等作用，為后期