基于TGF-β-Smad-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的補(bǔ)陽(yáng)還五湯拮抗肺纖維化機(jī)制研究.pdf

1、肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)屬于纖維增殖性疾病的范疇，是多種原因所致的間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)共有的病理基礎(chǔ)過(guò)程，其病變主要累及肺間質(zhì)，也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管，以肺成纖維細(xì)胞的異常增生和膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為主要表現(xiàn)，至今發(fā)病機(jī)制不明，且沒(méi)有理想的治療方法。由于大多數(shù)肺部疾病最終轉(zhuǎn)歸為肺纖維化，并且隨著污染、環(huán)境惡化等因素，肺纖維化當(dāng)今在全

2、球的發(fā)病率呈不斷上升的趨勢(shì)，已成為嚴(yán)峻的健康問(wèn)題，因此對(duì)肺纖維化發(fā)生機(jī)制和有效藥物的研究具有非常重要的科學(xué)價(jià)值。研究顯示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是致纖維化關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，Smads通路介導(dǎo)的致纖維化作用與 ERK通路介導(dǎo)的促增殖作用在纖維化的發(fā)生發(fā)展中均是不可或缺的。肺纖維化屬中醫(yī)“肺痿”、“肺痹”等范疇，其病機(jī)為氣虛血瘀，故益氣活血法是治療肺纖維化的基本大法。我們

3、在前期對(duì)益氣活血法干預(yù)肺纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有抑制實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠肺組織 TGF-β1的過(guò)度表達(dá)，減少肺組織中羥脯氨酸含量，降低肺泡巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子含量的作用，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)肺纖維化的作用可能與其調(diào)控TGF-β/Smad/ERK信號(hào)通路有關(guān)?；诖耍覀円訲GF-β/Smad/ERK信號(hào)通路為切入點(diǎn)，將研究靶點(diǎn)精準(zhǔn)定位于肺纖維化形成的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯拮抗肺纖維化的可能作用機(jī)制，以期拓展補(bǔ)陽(yáng)還五湯的適用范

4、圍，為臨床研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以博萊霉素(bleomycetin,BLM)誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型為評(píng)價(jià)載體，從病理學(xué)、分子生物學(xué)角度探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控TGF-β/Smad/ERK信號(hào)通路的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)共分為四部分：
　　1.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺指數(shù)及肺組織形態(tài)學(xué)的影響
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過(guò)補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后，動(dòng)態(tài)觀察模型大鼠的一般情況（精神、攝食、毛色、活動(dòng)、體重等）、肺指數(shù)，采集肺組織

5、行HE染色和Masson染色，分析病肺組織肺泡炎及肺纖維化程度，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗肺纖維化的作用。
　　結(jié)果：①一般情況：假手術(shù)組大鼠皮毛光澤，行動(dòng)靈活，反應(yīng)敏捷，食量正常；模型組大鼠食欲下降，毛發(fā)凌亂、稀疏、部分脫毛嚴(yán)重，對(duì)外界刺激反應(yīng)慢、行動(dòng)遲緩，體重增長(zhǎng)緩慢；其余各給藥組隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推進(jìn)，活動(dòng)減少、食量下降等癥狀有不同程度的改善，體重逐漸增加；②肺指數(shù)：與假手術(shù)相比，模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺指數(shù)增加明顯(p<0.01)；與模型組比

6、較，各給藥組大鼠肺指數(shù)有不同程度的下降(p<0.01)；與強(qiáng)的松對(duì)照組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組第14d、28d、低劑量組第28d肺指數(shù)降低較明顯(p<0.05)；高劑量組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺指數(shù)均高于強(qiáng)的松對(duì)照組，但與同期模型組相比仍較有明顯的降低。③病理形態(tài)學(xué)：與假手術(shù)相比，模型組及各給藥組大鼠可見肺泡結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞，肺間質(zhì)增生，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生形成；與模型組相比，給藥組各時(shí)間點(diǎn)的肺泡炎和肺纖維化程度均有不同程度的改善(p<0

7、.01)；其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組在中后期降低肺泡炎及纖維化程度方面明顯優(yōu)于同期強(qiáng)的松對(duì)照組(p<0.05)。
　　結(jié)論：博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型制備成功；補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠較好地控制模型大鼠肺指數(shù)的增長(zhǎng)，抑制早期的肺泡炎和中后期的肺纖維化。
　　2.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)博萊霉素所致肺纖維化大鼠血清纖維化指標(biāo)PCIII、IV-C、HA、LN含量的影響
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過(guò)補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后，采用放免法檢測(cè)各組大鼠血清纖維

8、化指標(biāo)PCIII、IV-C、HA、LN的含量，驗(yàn)證補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺纖維化的治療作用。
　　結(jié)果：①與假手術(shù)組相比，其它各組大鼠血清PCIII、IV-C、HA、LN的含量均逐漸升高，以模型組最為明顯(p<0.01)；②與模型組相比，各給藥組大鼠血清PCIII、IV-C、HA、LN含量均有不同程度降低(p<0.01)；③與強(qiáng)的松對(duì)照組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組第14d、28d以及補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組第28d時(shí)，PCIII、IV-C、HA、L

9、N含量下降明顯(p<0.05)。
　　結(jié)論：經(jīng)補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后的模型大鼠血清纖維化指標(biāo)含量有所下降，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以有效抑制病肺組織中膠原纖維的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，起到較好的抗肺纖維化作用。
　　3.補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控肺纖維化TGF-β1/Smad通路機(jī)制研究
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過(guò)補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后，采用免疫組化染色法(S-P法)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織Col-I、TβRI、TβRII、Smad3、Sm

10、ad7的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR法)檢測(cè)肺組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA的含量，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路干預(yù)肺纖維化的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：①與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達(dá)水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；Smad7、Smad7mRNA表達(dá)下降(p<0.01)；②與模型組相比，

11、各給藥組Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA有不同程度的下降(p<0.01 or p<0.05)；Smad7、Smad7mRNA表達(dá)增高(p<0.01 or p<0.05)；③與強(qiáng)的松對(duì)照組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中、低劑量組肺內(nèi)Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA的表達(dá)降低(p<0.01 or p<0.05)，Smad7、Smad7mRNA的表達(dá)增高(p<0.05)。

12、
　　結(jié)論：補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠有效抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路中發(fā)揮效應(yīng)的Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1、Smad3等因子的高表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)該通路中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控效應(yīng)的Smad7達(dá)增加，證實(shí)了補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠發(fā)揮較好的抗肺纖維化作用與其調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。
　　4.補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控肺纖維化TGF-β1/ERK通路機(jī)制研究
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過(guò)補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后，采用Western

13、 blot法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表達(dá)，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)調(diào)控TGF-β1/ERK通路干預(yù)肺纖維化的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：①與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；②與模型組相比，各給藥組TGF-β1、ERK1/2、p-ERK有不同程度的下降，差異明顯(p<0.01 or p<0.05)；③與強(qiáng)的松對(duì)照組

14、相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組在第14d、28d，低劑量組在第28d時(shí)TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表達(dá)明顯降低(p<0.05)。
　　結(jié)論：補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以有效抑制病肺組織TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表達(dá)上調(diào)，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠較好的調(diào)控肺纖維化中TGF-β1介導(dǎo)的ERK通路，進(jìn)而抑制其產(chǎn)生的促增殖作用。
　　綜上所述，本研究采用博萊霉素氣管滴注經(jīng)典造模方法制備大鼠肺纖維化模型，以TGF-β/Smad/ERK信

15、號(hào)通路為切入點(diǎn)，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)等研究技術(shù)和手段，從動(dòng)物水平探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)肺纖維化的可能作用機(jī)制。研究結(jié)果表明：補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以有效改善模型大鼠肺泡炎癥及肺纖維化程度，降低血清PCIII、IV-C、HA、LN含量，抑制TβRI、TβRII、Smad3、CollagenI、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA、ERK1/2、p-ERK蛋白在病肺組織中的過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)Smad7以及Smad7mRNA的活性，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以有效調(diào)控