Kindlin-2通過促進TGF-β-Smad信號通路加速腎臟纖維化.pdf

1、研究背景
　　 慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)已成為威脅全世界公共健康的主要疾病之一,嚴重危害人類健康及經(jīng)濟。流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,慢性腎臟病在中國、美國、日本、加拿大及伊朗的發(fā)病率已達到10％-13％,不亞于糖尿病和高血壓的發(fā)病率。此外,CKD發(fā)病還呈現(xiàn)出年輕化趨勢,二三十歲的透析患者越來越多,年齡最小的甚至不到10歲,令人震驚。因此,延緩腎臟疾病并減少腎臟損傷已刻不容緩。
　　 腎

2、臟纖維化是各種進展性腎病的最終通路。盡管腎臟纖維化的發(fā)病機制復雜,但大量研究證實TGF-β在腎臟纖維化中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用,與細胞的增殖、凋亡、活化、遷移、細胞外基質(zhì)合成有密切關(guān)系,參與腎纖維化的各個環(huán)節(jié)中,TGF-β被認為是最重要最強烈的纖維化誘導因子。TGF-β1誘導的生物學功能主要依賴其完整的Smads信號通路。TGF-β1首先與其Ⅱ型受體(TβRⅡ)結(jié)合,TβRⅡ磷酸化Ⅰ型受體(TβRⅠ),激活的TβRⅠ將活化Smad蛋白Sma

3、d2和Smad3,磷酸化的Smad2和Smad3隨后與Smad4一同進入細胞核,在核內(nèi)調(diào)控了TGF-β1靶基因的轉(zhuǎn)錄。雖然大家都熟知這個過程,但是TGF-β1受體與Smad2和Smad3相互作用的機制還有待深入探索,研究發(fā)現(xiàn)在這過程中有多種銜接蛋白分子對其進行著調(diào)控從而促進TGF-β1-Smad信號。
　　 腎臟纖維化的病理特征是過量的細胞外基質(zhì)(ECM)的積聚和沉積,而肌成纖維細胞(MFB)是導致病理條件下腎間質(zhì)中ECM過度沉

4、積的主要效應(yīng)細胞。研究證實上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化((epithelial-mesenchymal transition,EMT)是MFB來源的一個重要機制。EMT,是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下失去其上皮表型向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。已有越來越多的研究強有力地證實了EMT在不同類型的腎臟疾病中發(fā)揮著重要作用,而逆轉(zhuǎn)EMT則能有效改善腎臟纖維化。雖然大量研究揭示了各種EMT的始動因素、調(diào)節(jié)因子及存在的信號通路,但是在所有的因素中,TGF-

5、β1是核心因子,啟動并調(diào)節(jié)EMT的全過程。
　　 我們的課題合作研究組發(fā)現(xiàn)Kindlin-2蛋白可以誘導乳腺癌細胞EMT而促進乳腺腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。這個發(fā)現(xiàn)引起了我們對Kindlin-2分子的關(guān)注,Kindlin-2是否也參與腎臟上皮細胞的EMT而促進腎臟纖維化呢?Kindlin-2是Kindlin蛋自家族的一種,Kindlin蛋白家族是一類新型的銜接蛋白,它能與整合素相互作用加強整合素的激活。研究還發(fā)現(xiàn)Kindlin-2在肌動蛋

6、白極化、細胞伸展及整合素連接激酶定位在黏著斑中發(fā)揮著必不可少的作用。另外,Kindlin-2在胚胎發(fā)育及腫瘤進展中發(fā)揮著重要功能。
　　 目前,有關(guān)Kindlin-2在腎臟中的作用鮮有報道。唯一的一篇也是最新的一篇文獻指出Kindlin-2通過與整合素的相互作用調(diào)節(jié)足細胞的粘附和纖維連接蛋白的沉積,文中還提出TGF-β能明顯增加足細胞Kindlin-2的表達,提示Kindlin-2可能參與腎臟疾病。我們分別以人近端腎小管上皮細胞

7、為體外模型,以小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型開展動物實驗并結(jié)合患有腎臟纖維化的臨床病人的腎臟活檢標本研究Kindlin-2在腎臟纖維化中的作用,并探討了Kindlin-2與TGF-β-Smad3信號通路的關(guān)系,闡明了具有創(chuàng)新性的分子機制。
　　 第一章 Kindlin-2參與TGF-β1誘導的人腎小管上皮細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)
　　 目的
　　 觀察Kindlin-2對HKC細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用；研究TG

8、F-β1對Kindlin-2的調(diào)節(jié)作用并探索Kindlin-2在TGF-β1誘導HKC細胞EMT中充當?shù)慕巧?br>　　 方法
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)腎小管上皮細胞HKC,不同劑量的TGF—β1(0、1、2、5及10ng/ml)作用于HKC細胞48小時或5ng/ml TGF—β1作用于HKC細胞不同時間(0、12、24、48及72小時),或5 ng/ml TGF-β1處理HKC細胞不同時間(0、12、24及48小時),Weste

9、rn blot及Real-Time PCR檢測E-cadherin、α-SMA及FN蛋白和mRNA的表達。
　　 2.在HKC細胞中瞬時轉(zhuǎn)染全長Kindlin-2質(zhì)粒和對照Flag載體48小時,Westernblot及Real-Time PCR檢測E-cadherin、α-SMA及FN蛋白和mRNA的表達。
　　 3.建立穩(wěn)定表達Kindlin-2和對照空載Flag的HKC細胞系,Western blot、Real-Ti

10、me PCR及免疫熒光檢測兩組細胞E-cadherin、α-SMA及FN的蛋白和mRNA表達。
　　 4.Kindlin-2 siRNA或Control siRNA作用HKC細胞24小時后,再用TGF-β1處理細胞48小時,Western blot及Real-Time PCR檢測E-cadherin、α-SMA及FN的蛋白和mRNA的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.TGF-β1以時間依賴的方式上調(diào)HKCα-SMA

11、蛋白(F=4.546,P=0.039)及mRNA表達(F=18.537,P=0.001),增加FN蛋白(F=5.784,P=0.015)及mRNA表達(F=20.468,P=0.002),而下調(diào)E-cadherin蛋白(F=7.457,P=0.011)及mRNA表達(F=19.246,P=0.001)。
　　 2.TGF-β1以時間依賴的方式上調(diào)HKC細胞Kindlin-2蛋白(F-4.275,P=0.028)和mRNA(F=1

12、6.909,P=0.000)的表達,同時,TGF-β1以劑量依賴的方式誘導HKC細胞Kindlin-2蛋白(F=4.732,P=0.021)和mRNA(F=5.843,P=0.021)的表達。
　　 3.短暫過表達Kindlin-248小時后,與Flag組相比,轉(zhuǎn)染Flag-Kindlin2的HKC細胞中α-SMA蛋白(t=-2.905,P=0.044)及mRNA表達顯著上調(diào)(t=-4.069,P=0.015),同樣FN的表達明

13、顯增加。而E-cadhcrin蛋白(t=3.135,P=0.035)及mRNA(t=4.546,P=0.010)表達顯著下調(diào)。
　　 4.穩(wěn)定表達Kindlin-2后,HKC的形態(tài)學發(fā)生改變,從原來的鵝卵石狀變成長梭形。穩(wěn)定表達Kindlin-2后,HKC細胞中α-SMA和FN蛋白及mRNA表達顯著上調(diào),E-cadhcdn蛋白和mRNA表達顯著下調(diào)。
　　 5.Kindlin-2 siRNA作用于HKC細胞后抑制TGF-

14、β1誘導的α-SMA蛋白(F=5.774,P=0.021)和mRNA(F=16.663,P=0.001)表達,同樣顯著抑制FN蛋白(F=18.046,P=0.001)和mRNA(F=19.035,P=0.000)的表達。而Kindlin-2siRNA能恢復被TGF-β1抑制的E-cadherin蛋白(F=12.054,P=0.002)和mRNA(F=7.218,P=0.012)的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.TGF—β

15、1以劑量和時間依賴的方式上調(diào)HKC細胞Kindlin-2的表達。
　　 2.Kindlin-2可以誘導HKC細胞的α-SMA和Fibronectin表達,抑NE-cadherin的表達,促進HKC細胞的EMT。
　　 3.TGF-β1誘導HKC細胞的EMT需要Kindlin-2的參與。
　　 第二章 Kindlin-2參與TGF-β1信號通路的機制研究
　　 目的
　　 研究Kindlin-2與S

16、mad3及TGF-β1受體的關(guān)系,探索Kindlin-2在TGF-β-Smad3信號通路中發(fā)揮的作用。
　　 方法
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)HKC細胞,實驗分組為:轉(zhuǎn)染空載Flag組、轉(zhuǎn)染Flag-Kindlin-2組、轉(zhuǎn)染空載Flag或Kindlin-248小時后加TGF—β1處理30分鐘組,分別提取細胞總蛋白,Western blot檢測Smad3的磷酸化。
　　 2.實驗分組為:轉(zhuǎn)染Control siRNA72

17、小時組、轉(zhuǎn)染Kindlin-2 siRNA72小時組、轉(zhuǎn)染control siRNA或Kindlin-2 SiRNA72小時后加TGF-β1處理30分鐘組,分別提取細胞總蛋白和核蛋白,Western blot檢測Smad3的磷酸化。
　　 3.實驗分組為:共轉(zhuǎn)染Control siRNA及Flag空載72小時組、共轉(zhuǎn)染Control siRNA及Flag空載72/b時后加TGF-β1處理30分鐘組、共轉(zhuǎn)染Kindlia-2 si

18、RNA及Flag空載72小時后加TGF-β1處理30分鐘組和共轉(zhuǎn)染Kindlin-2 siRNA及抵抗Kindlin-2 siRNA的質(zhì)粒72小時后TGF-β1處理30分鐘組,提取細胞總蛋白,Western blot檢測Smad3的磷酸化。
　　 4.轉(zhuǎn)染Flag-Kindlin-2至HKC細胞中,免疫共沉淀檢測Kindlin-2與Smad3的相互作用。
　　 5.轉(zhuǎn)染Flag-Kindlin-2-N端或C端至HKC細胞

19、中,GST-pull down檢測Kindlin-2與Smad3相互作用的區(qū)域定位。
　　 6.共轉(zhuǎn)染Flag-Kindliw2及HA-TβRⅠ或Flag-Kindlin-2及HA-TβRⅡ至HKC細胞中,免疫共沉淀檢測Kindlin-2與TβRⅠI和TβRⅡ的相互作用。
　　 7.共聚焦熒光顯微鏡觀察Kindlin-2與Smad3、TβRⅠ和TβRⅡ的共定位。
　　 8.免疫共沉淀檢測敲低Kindlin-2后對

20、Smad3與TβRⅠ的結(jié)合的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.Kindlin-2干預(yù)HKC細胞后,與對照組一樣均不能引起Smad3的磷酸化。在分別轉(zhuǎn)染Flag或Flag-Kindlin-248小時后再用TGF-β1作用30分鐘后,與Flag組相比,Kindlin-2明顯增加Smad3的磷酸化。
　　 2.Kindlin-2 siRNA處理HKCC細胞72小時后再與TGF-β1作用30分鐘,Kindlin-2siRNA

21、明顯抑制TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化及Smad3的核轉(zhuǎn)移。而抵抗Kindlin-2siRNA的質(zhì)粒有效恢復被Kindlin-2siRNA抑制的TGF-β1誘導的Smad3的激活。
　　 3.HKC細胞中轉(zhuǎn)染Flag-Kindlin-2,免疫共沉淀結(jié)果顯示Kindlin-2與Smad3有相互作用。GST-pull down結(jié)果顯示,Smad3的MH1段與Kindlin-2的N端有較強的相互作用,未觀察到Smad3的MH1段

22、與Kindlin-2的C端的相互作用,Smad3的MH2段與Kindlin-2的N端及C端均沒有相互作用。
　　 4.在HKC細胞中分別共轉(zhuǎn)入Flag-Kindlin-2和HA-TβRⅠ或Flag-Kindlin-2和HA-TβRⅡ,免疫共沉淀結(jié)果顯示,Kindlin-2和TβRⅠ及TβRⅡ均具有相互作用。
　　 5.HKC中轉(zhuǎn)染Flag-Kindlin-2,免疫共沉淀結(jié)果顯示Kiadlin-2與Smad3及TGF-β1

23、受體形成復合物。
　　 6.共聚焦熒光顯微鏡觀察結(jié)果證明Kindlin-2與Smad3、TβRⅠ及TβRⅡ具有共定位。在正常狀態(tài)下,定位區(qū)域主要分布在細胞膜上。在加入TGF-β1刺激后,Kindlia-2與Smad3在細胞核內(nèi)具有共定位。
　　 7.免疫共沉淀結(jié)果顯示Kindlia-2 siRNA抑制Smad3與TβRⅠ的結(jié)合,從而抑制TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化。
　　 結(jié)論
　　 1.Kind

24、lin-2不能激活Smad3,但是Kindlin-2與TGF-β1具有協(xié)同作用激活Smad3。
　　 2.TGF-β1引起Smad3的磷酸化需要Kindlin-2的參與。
　　 3.Kindlin-2分別與Smad3、TβRⅠ及TβRⅡ相互作用并形成復合物,在分布上發(fā)生共定位。
　　 4.敲低Kindlin-2后抑制Smad3與TGF-β1RⅠ的結(jié)合。
　　 第三章 Kindlin-2在腎臟纖維化中發(fā)揮重

25、要作用
　　 目的
　　 通過動物實驗探討Kindlin-2在腎臟纖維化中發(fā)揮的作用；檢測患有慢性腎病的臨床病人腎臟組織中Kindlin-2及p-Smad3的表達,探索Kindlin-2在慢性腎病中的作用并觀察Kindlin-2及p-Smad3表達的相關(guān)性。
　　 方法
　　 1.ICR小鼠隨機分為:注射Control siRNA假手術(shù)組(Control siRNA+Sham組),Control siRN

26、A單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUOO)模型組(Control siRNA+UUO組)及Kindlin-2 siRNA模型組(Kindlin-2 siRNA+UUO)。采用單側(cè)(左)輸尿管結(jié)扎方法,建立梗阻性腎小管間質(zhì)纖維化小鼠模型,Sham組只游離輸尿管而不結(jié)扎,在術(shù)前一周和術(shù)后一周內(nèi)通過尾靜脈注射Control siRNA或Kindlin-2 siRNA。術(shù)后7天處死動物,取出腎臟,分別用于免疫組織化學、Western blot和Real-Ti

27、me PCR。
　　 2.運用HE及Masson染色觀察腎臟組織形態(tài)學改變及膠原纖維的沉積,采用免疫組織化學法檢測測Kindlin-2、p-Smad3、α-平滑肌肌動蛋白(α—SMA)及纖維連接蛋白(Fibronectin)表達的部位和變化。
　　 3.Westernblot檢測Kindlin-2、p-Smad3、Smad3、α-SMA及Fibronectin的蛋白表達。Real-Time PCR檢測Kindlin-2、

28、α-SMA及Fibronectin的mRNA表達。
　　 4.利用免疫組織化學方法檢測病人標本中Kindlin-2及p-Smad3的表達。
　　 結(jié)果
　　 1.HE染色顯示:與假手術(shù)組比較,UUO模型組小鼠腎組織出現(xiàn)不同程度的腎小管擴張或部分腎小管萎縮、間質(zhì)面積增寬、間質(zhì)炎癥細胞浸潤。而Kindlin-2siRNA+UUO組,腎臟纖維化癥狀明顯改善。
　　 2.Masson染色結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較,

29、UUO模型組小鼠腎組織膠原在腎小球及間質(zhì)區(qū)顯著增多。而在Kindlin-2 siRNA+UUO組,膠原沉積癥狀明顯減少。
　　 3.免疫組化結(jié)果表明:Kindlin-2主要分布在腎小管細胞胞質(zhì)中,細胞核中也有表達,p-Smad3只分布在細胞核中,α-SMA及Fibronectin只分布在小管間質(zhì)中。與假手術(shù)組比較,UUO模型組小鼠腎組織Kindlin-2、p-Smad3、α-SMA及Fibronectin表達顯著增加。而Kind

30、lin-2 siRNA+UUO組,這些蛋白表達均明顯減少。
　　 4.Western blot結(jié)果證明:與假手術(shù)組相比,UUO模型組小鼠腎組織Kindlin-2、p-Smad3、α-SMA及Fibronectin的蛋白表達顯著增加,而Kindlin-2 siRNA+UUO組,Kindlin-2(F=18.540,P=0.003)、p-Smad3(F=14.735,P=0.005)、α-SMA(F=27.928,P=0.001)及

31、Fibronectin(F=56.200,P=0.000)蛋白表達均明顯減少。
　　 5.Real-Time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組比較,UUO模型組小鼠腎組織Kindlin-2、α-SMA及Fibronectin mRNA表達顯著增加,而Kindlin-2 siRNA+UUO組,Kindlin-2(F=9.913,P=0.013)、α-SMA(F=8.175,P=0.019)及Fibronectin(F=80.396,P=

32、0.000)mRNA表達均明顯減少。
　　 6.病人標本免疫組織化學顯示:與正常腎臟相比,患有腎臟纖維化的病人的腎組織中Kindlin-2及p-Smad3顯著增加,并且兩者具有正相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1.在小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中,Kindlin-2、P-Smad3、α-SMA和Fibronectin及表達顯著上調(diào)。
　　 2.敲低Kindlin-2有效減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠的腎臟纖維化。