香鱗毛蕨中黃酮代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與功能驗(yàn)證.pdf

1、香鱗毛蕨[Dryopteris fragrans(L)Schott]是一種多年生的天然藥用植物。在我國(guó)黑龍江省五大連池地區(qū)分布最為廣泛。香鱗毛蕨的生境具有特殊性，比較傾向于生長(zhǎng)在火山噴發(fā)后的熔巖地區(qū)，對(duì)一些特殊環(huán)境都有一定的適應(yīng)性，但是香鱗毛蕨自然生長(zhǎng)的種群一旦遭到破壞，恢復(fù)起來(lái)非常緩慢。迄今為止，一些研究人員主要在形態(tài)解剖學(xué)觀察、化學(xué)成分的提取分離及藥理活性等方面對(duì)香鱗毛蕨進(jìn)行研究，關(guān)于香鱗毛蕨中次生代謝途徑相關(guān)酶基因的研究進(jìn)行的較少

2、。隨著對(duì)香鱗毛蕨的不斷開(kāi)發(fā)利用，野生香鱗毛蕨面臨著瀕危的現(xiàn)狀，因此對(duì)人工種植高含量有效物質(zhì)香鱗毛蕨植株的研究迫在眉睫。
　　本論文主要是以香鱗毛蕨組織培養(yǎng)植株為材料，根據(jù)電子克隆獲得的序列及其他已知序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，分別克隆了香鱗毛蕨中的CHI、F3H、PAL及C4H基因的保守片段，同時(shí)初步篩選出了香鱗毛蕨中PAL基因家族的三個(gè)成員。利用Real-Time PCR方法對(duì)DfPAL基因家族DfPAL1、DfPAL2、DfP-

3、AL3及DfC4H四個(gè)基因在香鱗毛蕨中的不同組織及不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，初步確定對(duì)DfPAL3和DfC4H進(jìn)行深入地研究。本文采用RACE技術(shù)克隆了DfPAL3和DfC4H的cDNA全長(zhǎng)，利用生物信息學(xué)分析，對(duì)兩個(gè)序列的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定香鱗毛蕨的分類系統(tǒng)位置。同時(shí)成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-DfC4H和pBI121-DfCHS，通過(guò)侵花法對(duì)擬南芥野生型植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，

4、通過(guò)PCR方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株，收取T1代種子。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的第一代謝產(chǎn)物和終產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，來(lái)初步驗(yàn)證DfC4H和DfCHS基因在黃酮類化合物生物合成途徑中的功能，從而為提高代謝產(chǎn)物進(jìn)行基因調(diào)控提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究DfC4H和DfCHS基因在香鱗毛蕨中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究中得到的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.本論文通過(guò)對(duì)香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出黃酮代謝途徑關(guān)鍵酶基因四個(gè)，分別為DfCH-I、Df

5、F3H、DfPAL及DfC4H,同時(shí)又對(duì)這四個(gè)基因進(jìn)行了電子克隆。
　　2.從香鱗毛蕨中克隆了DfCHI基因保守序列，大小為452bp，與其他已知序列的一致性為55％-57％，GenBank序列號(hào)為KP658975。
　　3.從香鱗毛蕨中克隆了DfF3H基因保守序列，大小為693bp，與其他已知序列的一致性為63％-62％，GenBank序列號(hào)為KP658976。
　　4.從香鱗毛蕨中分離得到苯丙氨酸解氨酶基因家族的三

6、個(gè)成員，分別命名為DfPAL1、DfPAL2、Df-PAL3。保守片段長(zhǎng)度均為880 bp，三者之間的序列一致性為84.30％，GenBank序列號(hào)分別為:KF830704，KJ634145，KJ634146。通過(guò)Blastx分析得知，DfPAL1、DfPAL2和DfPAL3與已知序列的一致性分別為97％、96％及97％。
　　5.通過(guò)Real-Time PCR方法對(duì)DfPAL基因家族及DfC4H基因在不同組織部位及不同處理?xiàng)l件下

7、進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè)。結(jié)果分析可知，DfPAL3在配子體中的表達(dá)量最高，葉柄中次之，在孢子中的表達(dá)量最低，而DfPAL1和DfPAL2在這些部位的表達(dá)量很低，而且沒(méi)有什么明顯差異。DfC4H的變化趨勢(shì)與DfP-AL3大致相同。低溫、高溫以及紫外處理后發(fā)現(xiàn)，DfPAL2及DfC4H的表達(dá)量均變化較大，而DfPAL1和DfPAL3則表達(dá)量比較穩(wěn)定，且沒(méi)有明顯的差異。
　　6.通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)，首次從香鱗毛蕨中克隆出DfPAL

8、3的cDNA全長(zhǎng)，大小為2370bp，ORF長(zhǎng)度為1608bp，編碼535個(gè)氨基酸，GenBank序列號(hào)為KJ634146.2，DfPAL3蛋白ID為AID16057.2。生物信息學(xué)分析表明，DfPAL3蛋白的分子量、等電點(diǎn)、分子式分別為57.1966 kDa、5.88及C2537H4081N697O767S18，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為α型蛋白;蛋白功能區(qū)分析顯示，DfPAL3蛋白含有PAL的功能區(qū)域，是PAL的家族成員之

9、一;亞細(xì)胞定位分析表明，DfPAL3蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性最大;沒(méi)有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白;也沒(méi)有跨膜蛋白的存在;在DfPAL3蛋白的515-528氨基酸之間存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu);對(duì)其進(jìn)行糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析顯示，包含N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1、62和25;多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與松葉蕨、水韭、陰地蕨、蕨的相似性分別為73％、74％、77％及93％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，與蕨類植物陰地蕨和松葉蕨的親緣關(guān)

10、系最近，與裸子植物的親緣關(guān)系次之，與被子植物的親緣關(guān)系略遠(yuǎn)。
　　7.通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)，首次從香鱗毛蕨中克隆出DfC4H的cDNA全長(zhǎng)為2063bp，ORF長(zhǎng)度為1527bp，編碼508個(gè)氨基酸，GenBank序列號(hào)為KF830705.2。DfC4H蛋白ID為AHI17493.2。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其分子量、等電點(diǎn)、分子式分別為58.1908kDa、8.92、C2649H4189N719O719S18;為不穩(wěn)定的親水

11、性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為混合型蛋白;蛋白功能區(qū)預(yù)測(cè)表明，DfC4H蛋白含有細(xì)胞色素P450功能區(qū)域，是細(xì)胞色素P450的家族成員之一;定位分析顯示，DfC4H蛋白定位在細(xì)胞膜的可能性最大;DfC4H蛋白可能含有信號(hào)肽，在N端有膜蛋白的存在;也可能存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu);對(duì)其進(jìn)行糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析顯示，含有N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1、36和19;進(jìn)化分析表明，與蘚類植物小立碗蘚的親緣關(guān)系最近，與裸子植物次之，與被子

12、植物的親緣關(guān)系略遠(yuǎn)。
　　8.本文成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-DfC4H,通過(guò)侵花法對(duì)擬南芥野生型植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因DfC4H植株進(jìn)行檢測(cè)，獲得T1代種子。對(duì)T1代植株第一代謝產(chǎn)物對(duì)香豆酸含量的HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中的含量明顯高于野生型。通過(guò)對(duì)黃酮類化合物合成途徑的終產(chǎn)物花色素苷含量進(jìn)行測(cè)定，轉(zhuǎn)基因DfC4H植株中花色素苷的含量明顯高于野生型中的含量。
　　9.本文成功構(gòu)建了植物表達(dá)