香鱗毛蕨中黃酮代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與功能驗證.pdf

1、香鱗毛蕨[Dryopteris fragrans(L)Schott]是一種多年生的天然藥用植物。在我國黑龍江省五大連池地區(qū)分布最為廣泛。香鱗毛蕨的生境具有特殊性，比較傾向于生長在火山噴發(fā)后的熔巖地區(qū)，對一些特殊環(huán)境都有一定的適應(yīng)性，但是香鱗毛蕨自然生長的種群一旦遭到破壞，恢復(fù)起來非常緩慢。迄今為止，一些研究人員主要在形態(tài)解剖學(xué)觀察、化學(xué)成分的提取分離及藥理活性等方面對香鱗毛蕨進行研究，關(guān)于香鱗毛蕨中次生代謝途徑相關(guān)酶基因的研究進行的較少

2、。隨著對香鱗毛蕨的不斷開發(fā)利用，野生香鱗毛蕨面臨著瀕危的現(xiàn)狀，因此對人工種植高含量有效物質(zhì)香鱗毛蕨植株的研究迫在眉睫。
　　本論文主要是以香鱗毛蕨組織培養(yǎng)植株為材料，根據(jù)電子克隆獲得的序列及其他已知序列的保守區(qū)設(shè)計特異引物，分別克隆了香鱗毛蕨中的CHI、F3H、PAL及C4H基因的保守片段，同時初步篩選出了香鱗毛蕨中PAL基因家族的三個成員。利用Real-Time PCR方法對DfPAL基因家族DfPAL1、DfPAL2、DfP-

3、AL3及DfC4H四個基因在香鱗毛蕨中的不同組織及不同處理條件下的基因表達情況進行檢測，初步確定對DfPAL3和DfC4H進行深入地研究。本文采用RACE技術(shù)克隆了DfPAL3和DfC4H的cDNA全長，利用生物信息學(xué)分析，對兩個序列的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行了研究，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定香鱗毛蕨的分類系統(tǒng)位置。同時成功構(gòu)建了植物表達載體pBI121-DfC4H和pBI121-DfCHS，通過侵花法對擬南芥野生型植株進行遺傳轉(zhuǎn)化，

4、通過PCR方法檢測了轉(zhuǎn)基因植株，收取T1代種子。同時對轉(zhuǎn)基因植株的第一代謝產(chǎn)物和終產(chǎn)物進行測定，來初步驗證DfC4H和DfCHS基因在黃酮類化合物生物合成途徑中的功能，從而為提高代謝產(chǎn)物進行基因調(diào)控提供了理論依據(jù)，為進一步研究DfC4H和DfCHS基因在香鱗毛蕨中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究中得到的主要實驗結(jié)果如下:
　　1.本論文通過對香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，篩選出黃酮代謝途徑關(guān)鍵酶基因四個，分別為DfCH-I、Df

5、F3H、DfPAL及DfC4H,同時又對這四個基因進行了電子克隆。
　　2.從香鱗毛蕨中克隆了DfCHI基因保守序列，大小為452bp，與其他已知序列的一致性為55％-57％，GenBank序列號為KP658975。
　　3.從香鱗毛蕨中克隆了DfF3H基因保守序列，大小為693bp，與其他已知序列的一致性為63％-62％，GenBank序列號為KP658976。
　　4.從香鱗毛蕨中分離得到苯丙氨酸解氨酶基因家族的三

6、個成員，分別命名為DfPAL1、DfPAL2、Df-PAL3。保守片段長度均為880 bp，三者之間的序列一致性為84.30％，GenBank序列號分別為:KF830704，KJ634145，KJ634146。通過Blastx分析得知，DfPAL1、DfPAL2和DfPAL3與已知序列的一致性分別為97％、96％及97％。
　　5.通過Real-Time PCR方法對DfPAL基因家族及DfC4H基因在不同組織部位及不同處理條件下

7、進行表達量的檢測。結(jié)果分析可知，DfPAL3在配子體中的表達量最高，葉柄中次之，在孢子中的表達量最低，而DfPAL1和DfPAL2在這些部位的表達量很低，而且沒有什么明顯差異。DfC4H的變化趨勢與DfP-AL3大致相同。低溫、高溫以及紫外處理后發(fā)現(xiàn)，DfPAL2及DfC4H的表達量均變化較大，而DfPAL1和DfPAL3則表達量比較穩(wěn)定，且沒有明顯的差異。
　　6.通過RT-PCR和RACE技術(shù)，首次從香鱗毛蕨中克隆出DfPAL

8、3的cDNA全長，大小為2370bp，ORF長度為1608bp，編碼535個氨基酸，GenBank序列號為KJ634146.2，DfPAL3蛋白ID為AID16057.2。生物信息學(xué)分析表明，DfPAL3蛋白的分子量、等電點、分子式分別為57.1966 kDa、5.88及C2537H4081N697O767S18，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白;二級結(jié)構(gòu)預(yù)測為α型蛋白;蛋白功能區(qū)分析顯示，DfPAL3蛋白含有PAL的功能區(qū)域，是PAL的家族成員之

9、一;亞細胞定位分析表明，DfPAL3蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性最大;沒有發(fā)現(xiàn)信號肽，屬于非分泌性蛋白;也沒有跨膜蛋白的存在;在DfPAL3蛋白的515-528氨基酸之間存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu);對其進行糖基化和磷酸化位點分析顯示，包含N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位點個數(shù)分別為1、62和25;多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，與松葉蕨、水韭、陰地蕨、蕨的相似性分別為73％、74％、77％及93％。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，與蕨類植物陰地蕨和松葉蕨的親緣關(guān)

10、系最近，與裸子植物的親緣關(guān)系次之，與被子植物的親緣關(guān)系略遠。
　　7.通過RT-PCR和RACE技術(shù)，首次從香鱗毛蕨中克隆出DfC4H的cDNA全長為2063bp，ORF長度為1527bp，編碼508個氨基酸，GenBank序列號為KF830705.2。DfC4H蛋白ID為AHI17493.2。生物信息學(xué)分析預(yù)測其分子量、等電點、分子式分別為58.1908kDa、8.92、C2649H4189N719O719S18;為不穩(wěn)定的親水

11、性蛋白;二級結(jié)構(gòu)預(yù)測為混合型蛋白;蛋白功能區(qū)預(yù)測表明，DfC4H蛋白含有細胞色素P450功能區(qū)域，是細胞色素P450的家族成員之一;定位分析顯示，DfC4H蛋白定位在細胞膜的可能性最大;DfC4H蛋白可能含有信號肽，在N端有膜蛋白的存在;也可能存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu);對其進行糖基化和磷酸化位點分析顯示，含有N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位點個數(shù)分別為1、36和19;進化分析表明，與蘚類植物小立碗蘚的親緣關(guān)系最近，與裸子植物次之，與被子

12、植物的親緣關(guān)系略遠。
　　8.本文成功構(gòu)建了植物表達載體pBI121-DfC4H,通過侵花法對擬南芥野生型植株進行遺傳轉(zhuǎn)化，利用PCR方法對轉(zhuǎn)基因DfC4H植株進行檢測，獲得T1代種子。對T1代植株第一代謝產(chǎn)物對香豆酸含量的HPLC檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中的含量明顯高于野生型。通過對黃酮類化合物合成途徑的終產(chǎn)物花色素苷含量進行測定，轉(zhuǎn)基因DfC4H植株中花色素苷的含量明顯高于野生型中的含量。
　　9.本文成功構(gòu)建了植物表達