紅花離體再生體系的建立及黃酮類生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與鑒定.pdf

1、紅花（Carthamus tinctorius L.）是菊科一年或兩年生草本植物，其花是傳統(tǒng)活血化瘀中藥，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗凝血、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛。黃酮類化合物如羥基紅花黃色素A、山奈酚及其苷類、槲皮素及其苷類等是紅花的主要有效成分，其含量的高低直接影響紅花品質(zhì)的優(yōu)劣。因此，克隆并鑒定紅花黃酮類生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，對(duì)于闡明紅花品質(zhì)形成的分子機(jī)制具有重要意義，并為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控紅花黃酮類化合物的生

2、物合成奠定基礎(chǔ)。在植物體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因研究中，高效的離體再生體系是一個(gè)必要條件。本課題就紅花離體再生體系的建立及黃酮類生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆與鑒定進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探索。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從萌發(fā)6-8天的紅花無(wú)菌苗上剪下的子葉作為外植體有較高的再生芽誘導(dǎo)能力，培養(yǎng)溫度為白天24℃、晚上16℃;光照強(qiáng)度為9000lux;相對(duì)濕度在60％時(shí)最適合再生芽的誘導(dǎo)。培養(yǎng)基配方(14) MS0+ TDZ(12.0 mg/L)+IBA(2.5

3、 mg/L)+2-ip(1.5 mg/L)的誘導(dǎo)再生率最高，達(dá)到79.1％，并且此時(shí)再生芽長(zhǎng)勢(shì)最好，重現(xiàn)性高，是比較理想的紅花再生培養(yǎng)基配方。再生芽轉(zhuǎn)移到MS基本培養(yǎng)基上能夠順利伸長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)良好。
　　 Contig897、Contig1988、Contig2129、Contig3482、Contig3855是課題組前期篩選的紅花黃酮類生物合成途徑中高表達(dá)的黃烷酮-3-羥基化酶(F3H)候選基因。本實(shí)驗(yàn)以它們?yōu)檠芯繉?duì)象，通過(guò)RAC

4、E擴(kuò)增技術(shù)分別獲得了各Contig的5’和3’端，將其進(jìn)行測(cè)序和拼接后獲得了各基因全長(zhǎng)序列，并通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了5條基因全長(zhǎng)。生物信息學(xué)分析顯示，Contig897在核酸及蛋白水平上與其他植物的F3H高度同源(≥72％)，其編碼的氨基酸序列與SWISS-PROT酶數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物的F3H氨基酸序列的一致性達(dá)80.16％; Contig1988、Contig3482全長(zhǎng)序列編碼的氨基酸序列與番茄的預(yù)測(cè)黃酮醇合酶(FLS)或F3H片段序列

5、同源性分別為64％、45％，與SWISS-PROT酶數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物的F3H氨基酸序列的一致性分別達(dá)到74.83％、75.44％; Contig2129全長(zhǎng)序列編碼的氨基酸序列與蓖麻的預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)FLS或F3H序列同源性為60％，與SWISS-PROT酶數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物的F3H氨基酸序列的一致性達(dá)75.73％; Contig3855與大豆的預(yù)測(cè)FLS或F3H序列同源性為64％，與SWISS-PROT酶數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物的F3H氨基酸序列的一致

6、性達(dá)74.36％。
　　 隨后，嘗試將5條基因進(jìn)行原核表達(dá)以驗(yàn)證其功能。PCR擴(kuò)增得到了Contig897和Contig2129這兩個(gè)基因用于構(gòu)建原核重組質(zhì)粒的特異性片段P897和P2129，序列分析顯示，P897序列編碼的氨基酸序列是F3H的同源序列，可以嘗試進(jìn)行原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。P897片段和pET-32a(+)載體經(jīng)過(guò)酶切、連接反應(yīng)構(gòu)成重組質(zhì)粒后，成功轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS原核表達(dá)宿主菌中。對(duì)不同菌液濃度、不同誘導(dǎo)