香鱗毛蕨4CL基因家族的克隆及功能驗證.pdf

1、香鱗毛蕨是多年生藥用真蕨類植物，在我國以黑龍江省為分布中心，特別是五大連池地區(qū)分布面積較大。由于其獨特的生長環(huán)境和生長特點賦予了香鱗毛蕨獨特的藥用價值。香鱗毛蕨作為民間用藥，主要用于治療關節(jié)炎和各種皮膚病，包括銀屑病、痤瘡、皮疹和皮炎等，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨還具有較強的驅(qū)蟲、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒等多重作用。迄今為止，一些研究人員主要在形態(tài)解剖學觀察、化學成分的提取分離及藥理活性等方面對香鱗毛蕨進行研究，關于香鱗毛蕨中次生

2、代謝途徑相關酶基因的研究進行的較少。因此，模擬香鱗毛蕨特殊生境的溫光處理對香鱗毛蕨有效成分的積累，并從分子角度闡明其調(diào)控機制，為實現(xiàn)我國野生香鱗毛蕨資源的有效保護和有效成分的可持續(xù)利用提供理論依據(jù)，應用前景十分廣闊。
　　在植物體中，包括木質(zhì)素和黃酮類化合物等次級代謝產(chǎn)物都是由苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)生的，這些次級代謝產(chǎn)物不但對植物體自身具有重要的作用，而且對人體的健康具有重要作用，因此，苯丙烷代謝途徑及途徑中的關鍵酶成為人們研究的熱點

3、。在這條代謝途徑中，4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)位于主途徑向分支途徑過渡的關鍵點上，控制進入不同的苯丙烷類化合物代謝支路，產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物，并且研究發(fā)現(xiàn)4CL基因?qū)倩蚣易逍问?，不同?CL基因可控制代謝途徑的不同方向，研究4CL基因家族成員對次級代謝產(chǎn)物調(diào)控及次級代謝物質(zhì)的積累有重要意義，也為廣泛研究及應用香鱗毛蕨的次級代謝產(chǎn)物打下堅實基礎。
　　本試驗在前期的溫光誘導香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組的測序的研究中，確定苯丙烷類衍生物代

4、謝途徑是香鱗毛蕨黃酮類化合物的重要代謝途徑，這與被子植物的苯丙烷類代謝較為相似。其中，4-香豆酸輔酶A連接酶基因則是這個代謝途徑中的關鍵酶基因。目前，4CL基因在被子植物、裸子植物、苔蘚植物已經(jīng)被廣泛的研究，而對于蕨類植物中則鮮有報道。本研究結合本課題組對香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組測序結果的分析，從中篩選出4-香豆酸輔酶A連接酶基因，得到的主要試驗結果如下:
　　1.本研究通過從本組前期試驗獲得溫光處理的香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選并選定Unig

5、ene15437_All，Unigene18514_All，Unigene21777_All Unigene32945_All4條基因，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，4個基因與已知植物4CL基因具有高度同源性，并以此為核心片段，進行后續(xù)試驗。
　　2.本文中通過RACE技術，將獲得的4個核心片段進行全長的序列擴增，獲得4個全長基因，并將Unigene15437_All，Unigene18514_All，Unigene21777_All Uni

6、gene32945_All命名為Df4CL1、Df4CL2、Df4CL3、Df4CL4。進一步研究這四個基因，發(fā)現(xiàn)都具有兩個功能保守域BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG)及底物結合區(qū)SbdⅠ和SbdⅡ，并與公開發(fā)表的其他植物中的4CL基因具有高度的一致性。這4個基因之間的一致性為66.00％，編碼分別539、565、552和573個氨基酸，4個基因推測的氨基酸序列之間的一致性為56.59％。確定這4個基因為4-

7、香豆酸輔酶A連接酶基因，并確定為一個基因家族。
　　3.本文運用CHIPS、 CUSP和CodonW在線程序?qū)ψ灾骺寺〉南泖[毛蕨4CL基因(Df4CL)序列進行分析，并與大腸桿菌、酵母菌、擬南芥、煙草等基因進行比較，對了解Df4CL基因密碼子使用特性，為其選擇合適的表達系統(tǒng)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨4CL基因?qū)TGC選擇沒有偏向性，并且與小立碗蘚的密碼子使用偏好性相一致。在密碼子使用頻率上，Df4CL基因與擬南芥的差異小于

8、與煙草、大腸桿菌、酵母的差異;基于4CL基因的密碼子使用偏性的系統(tǒng)聚類分析表明，香鱗毛蕨與小立碗蘚、擬南芥聚為一類，因此預示香鱗毛蕨4CL基因更適合在擬南芥中外源表達。
　　4.通過在線軟件等生物信息學方法和手段分析香鱗毛蕨4CL蛋白的情況，研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨4CL的4個蛋白均屬于兩性蛋白質(zhì)，DF4CL2蛋白無跨膜區(qū)，DF4CL1、DF4CL3和DF4CL4蛋白有兩個跨膜區(qū)，4個蛋白均無信號肽，并預測了4CL蛋白的高級結構，為今后

9、對該蛋白的結構、功能和可能的酶催化機制、與底物結合位點等相關研究提供重要理論基礎。
　　5.香鱗毛蕨Df4CLs基因組織表達與總黃酮和總木質(zhì)素含量之間基本正相關，在基因表達量高的組織中總黃酮和總木質(zhì)素含量也較高，這說明從香鱗毛蕨中擴增出來的基因Df4CLs參與總黃酮和總木質(zhì)素含量的合成。
　　6.香鱗毛蕨4CL基因的表達還能被溫度激活。在低溫(4℃)或者高溫(35℃)條件下，4個基因都表現(xiàn)為先增大后減少的趨勢，而香鱗毛蕨中黃

10、酮類化合物含量和木質(zhì)素含量變化趨勢與之基本一致，但峰值點不相同，一般而言，黃酮類化合物和總木質(zhì)素含量達到最高點的峰值要比基因滯后，溫度除影響基因的表達量外，還可能影響物質(zhì)合成中酶的活性，導致含量的變化。
　　7.紫外線照射同樣會影響4CL基因及黃酮含量和木質(zhì)素含量。在紫外線照射下，基因Df4CL3和Df4CL4顯著增加，尤其是Df4CL3。而黃酮類化合物增加顯著，木質(zhì)素增加平緩。一般而言，在紫外線照射下，保護植物體防止紫外線輻射的

11、黃酮類物質(zhì)會顯著增加，這與我們得到的試驗結果也相一致。
　　8.本文成功構建了Df4CL2的原核表達體系表達出具有酶活性的重組蛋白，通過表達載體pET28a-Df4CL2中的HIS標簽成功純化出重組蛋白。
　　9.本文成功構建了植物表達載體pBI121-Df4CL1，通過浸花法對擬南芥野生型植株進行遺傳轉(zhuǎn)化。利用PCR方法對轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，獲得純合體轉(zhuǎn)基因植株，并對黃酮化合物和木質(zhì)素含量進行檢測，結果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中的