黃瓜類黃酮合成相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、果刺顏色是黃瓜（Cucumis sativus L.）非常重要的外觀品質(zhì)，并且在生物脅迫中對黃瓜起著很重要的保護(hù)作用。雖然前人研究結(jié)果已揭示黃瓜黑刺對白刺為顯性性狀，由一對等位基因控制，同時(shí)控制橙色果皮性狀，并且，CsMYB60被認(rèn)為是控制黑刺和橙色果皮顏色的最佳候選基因，但是，該基因的功能以及如何調(diào)控黑刺形成仍然未知，而且黑刺中積累何種次生代謝物質(zhì)，也未見報(bào)道。我們課題組前期研究結(jié)果表明，黑刺黃瓜果刺中積累的次生代謝物質(zhì)主要是類黃酮;

2、而且，黑刺黃瓜的果皮中也有類黃酮的積累。由于類黃酮對植物抗性以及人類健康具有重要的作用，因此，研究黃瓜中類黃酮合成相關(guān)基因的功能，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　課題組利用黃瓜黑刺品系(V05A0071，國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫編號)和白刺品系（V05A0672，國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫編號）雜交構(gòu)建的F2群體，采用分離分組分析法(BSA, Bulked Segregant Analysis)，分別對黑刺和白刺取樣混池，進(jìn)行

3、轉(zhuǎn)錄組測序。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取了與類黃酮合成相關(guān)的一些差異表達(dá)較明顯的酶基因，包括Cs4CL、CsCHS、CsF3H、 CsLAR、CsGST,先進(jìn)行半定量及熒光定量PCR驗(yàn)證，并分析它們在黃瓜果皮發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，這些基因在黑刺黃瓜果皮中的表達(dá)量明顯高于在白刺黃瓜果皮中的表達(dá)量。
　　然后，克隆這些基因并構(gòu)建了過表達(dá)載體，利用果刺瞬時(shí)系統(tǒng)，對這些結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行功能分析，結(jié)果表明只有Cs4CL

4、過表達(dá)可以使白刺中積累類黃酮物質(zhì)。盡管本課題組其他人員通過果刺瞬時(shí)系統(tǒng)證明CsMYB60確實(shí)參與黑刺顏色形成，但是酵母單雜和GUS瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CsMYB60不能直接調(diào)控Cs4CL的表達(dá)。
　　同時(shí)，對黃瓜、番茄和擬南芥進(jìn)行Cs4CL的遺傳轉(zhuǎn)化，但是只得到了轉(zhuǎn)基因番茄和擬南芥。對轉(zhuǎn)基因植株檢測后發(fā)現(xiàn)，Cs4CL過表達(dá)能提高番茄葉片中木質(zhì)素的含量，以及番茄葉片和果實(shí)中總酚、類黃酮的含量;并且能夠提高擬南芥葉片中總酚、類黃酮和