版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、中耳膽脂瘤是一種在中耳和乳突腔內(nèi)的非腫瘤的疾病,其病理學特征包括鱗狀上皮角化功能受損、上皮增生的同時伴有異常的上皮內(nèi)細微結(jié)構(gòu)的變化如微膽脂瘤的形成、基底膜的破壞、斷裂,膽脂瘤上皮下組織炎性細胞的浸潤等。臨床表現(xiàn)主要有耳痛、流膿、聽力下降,嚴重的可波及面神經(jīng)引起面癱、波及半規(guī)管導(dǎo)致眩暈及顱內(nèi)外的感染危及生命,而這一切的原因都是膽脂瘤對臨近骨質(zhì)的破壞吸收所致。
目前膽脂瘤發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確。從分子生物學上研究發(fā)現(xiàn)多種因素,如增
2、生、凋亡、分化、炎癥、感染、骨質(zhì)破壞、脂類代謝、血管發(fā)生在膽脂瘤的形成和臨床表現(xiàn)方面有著一定的作用,其中增生、分化和凋亡的異常表現(xiàn)是膽脂瘤上皮的最基本特征。研究多以與正常皮膚上皮的生物學特性相比較,發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮增殖的能力異常增高,這種高度的增殖同腫瘤細胞是類似的已達成共識,目前分歧最大的地方是關(guān)于凋亡,包括凋亡能力、凋亡發(fā)生的途徑及凋亡的意義。細胞凋亡(apoptosis)是一種自主性死亡過程,由特定基因控制,在多種病理生理過程中是不
3、可缺少的。一些學者認為膽脂瘤上皮細胞的凋亡能力增加,過度凋亡導(dǎo)致的膽脂瘤上皮脫落形成的角化物的聚集同膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),而且凋亡水平的變化同膽脂瘤的骨質(zhì)吸收與復(fù)發(fā)、殘留有關(guān),而另一些研究的結(jié)果則傾向于膽脂瘤上皮細胞中凋亡能力受到了阻滯,導(dǎo)致凋亡周期延長,細胞存在抗凋亡(anti-apoptosis)作用。
研究發(fā)現(xiàn),細胞增殖、分化和死亡、遷移等多種生物學過程均受一類長20-30nt的小RNA分子即Micro(mi)RNA的調(diào)
4、控,miRNA可以通過沉默其靶基
因表達來發(fā)揮調(diào)控作用,其作用方式是與靶基因mRNA3’端非翻譯區(qū)里的特異的結(jié)合位點結(jié)合。多項研究表明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后同miRNA的作用密切相關(guān),同時miRNA在多種異常增生性疾病和代謝性疾病中也發(fā)生了明顯的變化。Friedland等以耳后皮膚組織為對照,采用RT-PCR技術(shù)首次檢測到八種miRNAs在膽脂瘤組織中的表達發(fā)生上調(diào),其中miRNA-21的表達量改變最高,平均高于對照組4.4倍
5、,其下游靶基因為PTEN和PDCD。2011年陳曉華研究了膽脂瘤上皮增殖和凋亡的相互關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),凋亡相關(guān)miRNA(apoptotic-associated miRNA)let-7a在膽脂瘤上皮表達上調(diào)。Let-7 microRNA家族是目前研究最廣泛的microRNA之一,在調(diào)控細胞的增殖和凋亡方面均有作用途徑參與。在大多數(shù)腫瘤呈現(xiàn)低表達,提示let-7 microRNA的功能抑制與腫瘤的凋亡能力下降密切相關(guān),而其在膽脂瘤中的高表
6、達提示其對膽脂瘤細胞的調(diào)控模式顯然不同于在腫瘤細胞中的作用方式。2015年張文靜從Let-7a microRNA對膽脂瘤細胞增生的影響進行研究,發(fā)現(xiàn)Let-7a microRNA通過抑制miRNA-21的作用而影響了細胞的增生,然而從miRNA水平研究膽脂瘤凋亡以及l(fā)et-7 microRNA參與中耳膽脂瘤凋亡的調(diào)控作用及具體途徑的研究國內(nèi)外尚未見報道。相對于成人膽脂瘤來說,小兒膽脂瘤通常具有更強的攻擊性、侵襲性和復(fù)發(fā)性,既往研究表明凋
7、亡的差異與膽脂瘤骨質(zhì)破壞、復(fù)發(fā)有關(guān),因而凋亡在上述兩種膽脂瘤中的表現(xiàn)有無差異以及miRNA在其中起到的作用如何值得進一步研究。
目的:
1.觀察兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤的凋亡能力的差異以及miRNA-let-7c及其靶蛋白Bcl-xl在兩種膽脂瘤中的表達情況,研究miRNA-let-7c與凋亡在膽脂瘤發(fā)生中的作用。
2.以攜帶miRNA-let-7c抑制體的慢病毒載體感染培養(yǎng)的膽脂瘤上皮角質(zhì)細胞,觀察下調(diào)mi
8、RNA-let-7c對膽脂瘤角質(zhì)細胞中miRNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl表達情況以及對細胞凋亡能力的影響。
3.觀察miRNA-let-7c inhibitor干擾膽脂瘤細胞凋亡的具體途徑,以期闡明膽脂瘤中miRNA-let-7c介導(dǎo)凋亡的發(fā)生機制,為我們認識miRNA在中耳膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供新的理論依據(jù)。
第一部分、miRNA-let-7c在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤組織中的表達研究
9、 方法:
1.利用TUNEL法檢測29例兒童中耳膽脂瘤(年齡≤14歲)、29例成人中耳膽脂瘤(年齡≥18歲)的凋亡的差異,同時以相應(yīng)的兒童、成人耳后正常皮膚組織作為對照。
2.提取29例成人膽脂瘤組織、29例兒童膽脂瘤組織和耳后皮膚組織中的mRNAs,其濃度和純度的檢測通過紫外分光光度儀獲得。
3.利用 RT-PCR技術(shù)檢測兒童膽脂瘤、成人膽脂瘤組織和其對照組中miRNA-let-7c的表達。
4
10、.采用免疫印跡技術(shù)檢測中耳膽脂瘤組織及對照組中Bcl-xl蛋白的表達。
結(jié)果:
1.膽脂瘤上皮的凋亡同耳后皮膚組織相比,凋亡顯著高于皮膚組(P<0.05);成人中耳膽脂瘤上皮的凋亡能力高于兒童膽脂瘤(P<0.05);兩組耳后正常皮膚組織間的凋亡無差異(P>0.05)。
2.成人膽脂瘤組織中 miRNA-let-7c的表達是對照組的11.96±0.09倍(P<0.05);兒童膽脂瘤組織中miRNA-let-7
11、c的表達是對照組的7.94±0.04倍(P<0.05);兒童和成人膽脂瘤間miRNA-let-7c的表達差異也有統(tǒng)計學差異(P<0.05);miRNA-let-7c在兩組耳后皮膚上皮間的相對表達量無差異(P>0.05)。
3.MiRNA-let-7c下游靶基因Bcl-xl在兩種膽脂瘤中均呈現(xiàn)低表達,在成人膽脂瘤中的表達更低(P<0.05)。
第二部分、下調(diào)miRNA-let-7c對膽脂瘤角質(zhì)細胞中miRNA-let-
12、7c及其靶基因的表達以及細胞凋亡的影響
方法:
1.采用兩步消化法獲取中耳膽脂瘤上皮角質(zhì)細胞,在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。通過顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并進而利用角質(zhì)細胞角蛋白抗體行免疫熒光化學方法檢測對角質(zhì)細胞的性質(zhì)進行鑒定。
2.實驗分組:miR-let-7c-inhibitor組(實驗組),miR-let-7c-inhibitor NC組(陰性對照組),Mock組(空白對照組)。
3.利用攜帶miR
13、NA-let-7c inhibitor的慢病毒載體和miRNA-let-7c inhibitor NC的慢病毒載體感染膽脂瘤角質(zhì)細胞,同時以空白對照組作為對照,培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率,利用RT-PCR技術(shù)檢測miRNA-let-7c的表達是否下調(diào)。
4.利用western blotting和RT-PCR技術(shù)檢測miR-let-7c inhibitor干擾對膽脂瘤角質(zhì)細胞中Bcl-xl蛋白和mRNA表達的影響。
14、r> 5.將感染miRNA-let-7c inhibitor慢病毒后的膽脂瘤角質(zhì)細胞、陰性對照組和空白對照組細胞接種于96孔板中,共培養(yǎng)10天,每天取3孔通過檢測OD值,繪制生長曲線。
6.如上方法處理膽脂瘤細胞96h后,三組細胞均進行碘化丙啶染色30分鐘后,用FCM法測定細胞凋亡及周期的改變。
7.如上方法處理膽脂瘤細胞96h后利用Annexin V-FITC染色法觀察細胞早期凋亡狀況,TUNEL原位酶標記在熒光
15、顯微鏡下觀察膽脂瘤細胞的凋亡。
結(jié)果:
1.兩步消化法之后采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲得足夠數(shù)量的膽脂瘤上皮角質(zhì)細胞,利用角蛋白抗體檢測提取獲得的膽脂瘤角質(zhì)上皮細胞的純度可達90%以上,可用于后續(xù)實驗。
2.MiR-let-7c-inhibitor組的膽脂瘤角質(zhì)細胞中miRNA-let-7c的表達顯著低于miR-let-7c-NC組和Mock組,miRNA-let-7c在miR-let-7c-NC組中的表達是m
16、iR-let-7c-inhibitor組的10.19±0.26倍,在Mock組中的表達是miR-let-7c-inhibitor組的10.92±0.31倍,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而在miR-let-7c-NC組和Mock組中的表達無差異(P>0.05)。
3. Bcl-xl蛋白在膽脂瘤角質(zhì)細胞miR-let-7c-inhibitor組的表達較miR-let-7c-NC組和Mock組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義( P
17、<0.05);在miR-let-7c-NC組和Mock組中的表達無明顯差異(P>0.05)。而Bcl-xl mRNA在miR-let-7c-inhibitor組的表達同miR-let-7c-NC組和Mock組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
4.MiRNA-let-7c inhibitor干擾后膽脂瘤上皮角質(zhì)細胞生長速度較兩對照組明顯增快,第5天miR-let-7c-inhibitor組的OD值與miR-let-7c-NC組
18、和Mock組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),第9天時miR-let-7c-inhibitor組因細胞密度過大,死亡細胞增多。
5.MiRNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細胞96h后,凋亡細胞比例下降,同miR-let-7c-NC組和Mock組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞周期分布出現(xiàn)明顯改變,S期細胞的數(shù)量增多(P<0.05),G0/G1期細胞比例的下降(P<0.05),即miRNA-l
19、et-7c inhibitor促使膽脂瘤角質(zhì)細胞從G0/G1期進入S期。
6.MiRNA-let-7c inhibitor感染后96h,Annexin V-FITC檢測膽脂瘤角質(zhì)細胞的早期凋亡率明顯減少(P<0.05);TUNEL法檢測膽脂瘤角質(zhì)細胞凋亡比例也明顯減少(P<0.05)。
第三部分、miRNA-let-7c參與膽脂瘤上皮角質(zhì)細胞凋亡的分子機制研究
方法:
1.利用western bl
20、otting檢測膽脂瘤組織及耳后皮膚組織中Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達。
2.利用攜帶miRNA-let-7c inhibitor的慢病毒載體感染膽脂瘤角質(zhì)細胞,實驗分組:miR-let-7c-inhibitor組(實驗組),miR-let-7c-NC組(陰性對照組),Mock組(空白對照組)。
3.如上方法處理膽脂瘤細胞72小時后利用western blo
21、tting檢測miR-let-7c inhibitor干擾對膽脂瘤角質(zhì)細胞中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、pro-caspase-3、pro-caspase-9和cytochrome C、Smac蛋白表達的影響。
4.如上方法處理膽脂瘤細胞96小時后進行JC-1染色,之后檢測三組細胞線粒體膜電位的差異。
5.如上方法處理膽脂瘤細胞96小時后利用分光光度儀檢測caspase-3和caspase-9的活性。
結(jié)
22、果:
1.膽脂瘤組織同耳后皮膚組織相比,Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達均增加。
2.MiRNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細胞72h后Bax、cytochrome C、Smac的表達明顯減少(P<0.05),而pro-caspase-3、pro-caspase-9的表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
3.MiRNA-
23、let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細胞96h后線粒體膜電位檢測中綠色熒光值明顯下降,表明線粒體膜電位上升(P<0.05)。
4.MiRNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細胞96h后caspase-3和caspase-9的活性明顯降低(P<0.05)。
結(jié)論
1.中耳膽脂瘤凋亡水平升高和miRNA-let-7c的表達上調(diào),從miRNA水平驗證了膽脂瘤的高凋亡狀態(tài)的非腫瘤性質(zhì)。
24、r> 2.MiRNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl和凋亡在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤中的表達有差異,這種差異提示兒童膽脂瘤的抗凋亡機制參與到了其發(fā)病機制中。
3.MiRNA-let-7c inhibitor慢病毒可有效沉默膽脂瘤角質(zhì)細胞中miRNA-let-7c的表達,通過在翻譯水平的負性調(diào)控機制使其靶基因Bcl-xl蛋白的表達升高。
4.MiR-let-7c通過阻斷細胞周期促進細胞凋亡,且以早中期細胞凋亡為主。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- MicroRNA let-7a對睪丸卵黃囊瘤細胞增殖和凋亡的影響.pdf
- 膽脂瘤型中耳炎-a
- 中耳膽脂瘤溶骨相關(guān)因素的研究.pdf
- 膽脂瘤中耳炎護理查房
- 82例中耳膽脂瘤臨床病例分析.pdf
- HGF、VEGF在中耳膽脂瘤中的表達及意義.pdf
- microRNa-33-122調(diào)控草魚肝臟脂質(zhì)代謝的作用及分子機制研究.pdf
- 中耳先天性膽脂瘤誤診原因分析.pdf
- CyclinD1在中耳膽脂瘤中的表達及意義.pdf
- URI對骨髓瘤細胞調(diào)控作用及機制研究.pdf
- RNA干擾VEGF-A--C對神經(jīng)母細胞瘤細胞生長及凋亡的作用及機制研究.pdf
- MMP9及VEGF誘導(dǎo)血管生成在中耳膽脂瘤增殖中的作用.pdf
- 常規(guī)MRI及彌散加權(quán)成像診斷中耳膽脂瘤的應(yīng)用價值研究.pdf
- let-7a靶向調(diào)控NIRF基因?qū)Ψ伟〢549細胞增殖的影響及分子機制研究.pdf
- microRNA-145對乳腺癌細胞系MCF7的調(diào)控作用及其分子機制研究.pdf
- T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury調(diào)控脊索瘤細胞凋亡的作用與分子機制.pdf
- LeT-7b調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞化療耐藥的分子機理研究.pdf
- 膽脂瘤型中耳炎聽骨病變殘留的研究.pdf
- CD147和MMP-2在外耳道膽脂瘤與中耳膽脂瘤中表達的研究.pdf
- 膽脂瘤型中耳炎患者的護理查房
評論
0/150
提交評論