MicroRNA let-7a對睪丸卵黃囊瘤細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度為20～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其序列在物種間高度保守。MicroRNA參與調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育和凋亡等過程，其失調(diào)與人類很多疾病相關，包括腫瘤。研究表明幾乎所有的惡性腫瘤均能發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達和（或）突變。這些異常的miRNA，于轉錄后水平通過沉默或抑制靶mRNA的表達，起癌基因或者抑癌基因的作用。MicroRNAlet-7a是目前研究最廣泛的mi

2、RNA之一，在肺癌、結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等多數(shù)腫瘤中低表達，具有抑制腫瘤細胞增殖、促進分化和凋亡等多種生物學功能。已有研究初步表明miRNA let-7a在睪丸惡性腫瘤中也呈低表達，但其具體功能及機制尚不清楚。睪丸卵黃囊瘤是兒童睪丸腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，let-7a在其發(fā)生發(fā)展中起怎樣的作用以及作用的機制，需要我們進一步的研究。本課題以原代培養(yǎng)的睪丸卵黃囊瘤細胞YST為研究對象，對let-7a在YST細胞功能中所發(fā)揮的作用及作

3、用機制進行初步探索，為未來的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　構建miR-let-7a慢病毒表達載體，探討過表達microRNA let-7a對睪丸卵黃囊瘤YST細胞增殖和凋亡的影響，并對其作用機制進行初步探索。
　　方法:
　　1.利用慢病毒載體GV254，構建miR-let-7a過表達載體。通過感染睪丸卵黃囊瘤細胞YST，并用嘌呤霉素抗性篩選，得到穩(wěn)定轉染的YST細胞株，行熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)

4、miRNA let-7a的表達。
　　2.為了研究過表達miR-let-7a對YST細胞產(chǎn)生的影響，我們將試驗分為三組:miR-let-7a慢病毒感染組;陰性病毒對照組;未感染空白對照組。利用CCK-8法、流式細胞儀檢測let-7a對YST細胞增殖及凋亡的影響。
　　3.利用miRBase、TargetScan、PicTar等microRNA靶基因預測軟件，結合文獻查閱，找出與細胞增殖和凋亡密切相關的靶基因IGF-1R，應用

5、western-blot檢測候選靶基因IGF-1R及其下游信號分子AKT的蛋白表達水平，并用RT-qPCR檢測各組細胞中IGF-1R mRNA的表達變化。
　　結果:
　　1.利用miR-let-7a慢病毒表達載體成功感染人睪丸卵黃囊瘤YST細胞。利用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定細胞系后，RT-qPCR檢測結果顯示，miR-let-7a慢病毒感染組細胞內(nèi)let-7a水平比陰性病毒對照組和空白對照組分別提高3.0倍和3.8倍(p＜0.0

6、5)，成功獲得過表達miR-let-7a的穩(wěn)定亞細胞系。
　　2.CCK-8法細胞增殖試驗結果顯示，較空白組和陰性病毒組，miR-let-7a慢病毒感染組細胞的增殖能力明顯受到抑制(p＜0.05);流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，感染miR-let-7a慢病毒組凋亡率[(14.1±1.4)％]，與陰性病毒組[(2.1±1.0)％]和空白對照組[(2.03±0.98)％]相比，明顯增高(p＜0.05)。
　　3.利用miRBa

7、se、TargetScan、PicTar等生物信息學預測軟件對miR-let-7a的靶基因進行預測，找出與細胞增殖和凋亡相關的靶基因，并結合文獻查閱，初步候選IGF-1R作為miR-let-7a的靶基因進行研究。應用RT-qPCR檢測IGF-1R在三組細胞中的表達，結果顯示，miR-let-7a慢病毒感染組與陰性病毒對照組和空白對照組相比，IGF-1R的mRNA表達量出現(xiàn)明顯下降(p＜0.05);Western blot結果顯示，與陰性

8、對照組和空白對照組相比，感染miR-let-7a的YST細胞中IGF-1R蛋白表達水平下降(p＜0.05)，IGF-1R介導的下游AKT信號通路受到抑制，表現(xiàn)為AKT磷酸化水平(p-AKT)水平降低(p＜0.05)，而總的AKT水平未受明顯影響。
　　結論:
　　1.構建的miR-let-7a慢病毒載體能有效感染原代睪丸卵黃囊瘤細胞，并顯著提高睪丸卵黃囊瘤細胞中miR-let-7a的表達水平。
　　2.過表達miR-l

9、et-7a能顯著抑制體外培養(yǎng)的睪丸卵黃囊瘤細胞的增殖能力，促進細胞凋亡。
　　3.進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-let-7a可以干擾睪丸卵黃囊瘤細胞中IGF-1R基因及其蛋白的表達，并引起IGF-1R下游通路AKT磷酸化水平降低。IGF-1R/AKT通路可能是miR-let-7a抑制睪丸卵黃囊瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的機制。
　　綜上所述，microRNA let-7a在睪丸卵黃囊瘤中也發(fā)揮著抑癌基因的作用，可能是通過抑制靶基因I