MicroRNA let-7a對睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度為20～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其序列在物種間高度保守。MicroRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育和凋亡等過程，其失調(diào)與人類很多疾病相關(guān)，包括腫瘤。研究表明幾乎所有的惡性腫瘤均能發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)和（或）突變。這些異常的miRNA，于轉(zhuǎn)錄后水平通過沉默或抑制靶mRNA的表達(dá)，起癌基因或者抑癌基因的作用。MicroRNAlet-7a是目前研究最廣泛的mi

2、RNA之一，在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等多數(shù)腫瘤中低表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)分化和凋亡等多種生物學(xué)功能。已有研究初步表明miRNA let-7a在睪丸惡性腫瘤中也呈低表達(dá)，但其具體功能及機(jī)制尚不清楚。睪丸卵黃囊瘤是兒童睪丸腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，let-7a在其發(fā)生發(fā)展中起怎樣的作用以及作用的機(jī)制，需要我們進(jìn)一步的研究。本課題以原代培養(yǎng)的睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞YST為研究對象，對let-7a在YST細(xì)胞功能中所發(fā)揮的作用及作

3、用機(jī)制進(jìn)行初步探索，為未來的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　構(gòu)建miR-let-7a慢病毒表達(dá)載體，探討過表達(dá)microRNA let-7a對睪丸卵黃囊瘤YST細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　方法:
　　1.利用慢病毒載體GV254，構(gòu)建miR-let-7a過表達(dá)載體。通過感染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞YST，并用嘌呤霉素抗性篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的YST細(xì)胞株，行熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)

4、miRNA let-7a的表達(dá)。
　　2.為了研究過表達(dá)miR-let-7a對YST細(xì)胞產(chǎn)生的影響，我們將試驗分為三組:miR-let-7a慢病毒感染組;陰性病毒對照組;未感染空白對照組。利用CCK-8法、流式細(xì)胞儀檢測let-7a對YST細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　3.利用miRBase、TargetScan、PicTar等microRNA靶基因預(yù)測軟件，結(jié)合文獻(xiàn)查閱，找出與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的靶基因IGF-1R，應(yīng)用

5、western-blot檢測候選靶基因IGF-1R及其下游信號分子AKT的蛋白表達(dá)水平，并用RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中IGF-1R mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.利用miR-let-7a慢病毒表達(dá)載體成功感染人睪丸卵黃囊瘤YST細(xì)胞。利用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定細(xì)胞系后，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-let-7a慢病毒感染組細(xì)胞內(nèi)let-7a水平比陰性病毒對照組和空白對照組分別提高3.0倍和3.8倍(p＜0.0

6、5)，成功獲得過表達(dá)miR-let-7a的穩(wěn)定亞細(xì)胞系。
　　2.CCK-8法細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示，較空白組和陰性病毒組，miR-let-7a慢病毒感染組細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制(p＜0.05);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，感染miR-let-7a慢病毒組凋亡率[(14.1±1.4)％]，與陰性病毒組[(2.1±1.0)％]和空白對照組[(2.03±0.98)％]相比，明顯增高(p＜0.05)。
　　3.利用miRBa

7、se、TargetScan、PicTar等生物信息學(xué)預(yù)測軟件對miR-let-7a的靶基因進(jìn)行預(yù)測，找出與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的靶基因，并結(jié)合文獻(xiàn)查閱，初步候選IGF-1R作為miR-let-7a的靶基因進(jìn)行研究。應(yīng)用RT-qPCR檢測IGF-1R在三組細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-let-7a慢病毒感染組與陰性病毒對照組和空白對照組相比，IGF-1R的mRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降(p＜0.05);Western blot結(jié)果顯示，與陰性

8、對照組和空白對照組相比，感染miR-let-7a的YST細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達(dá)水平下降(p＜0.05)，IGF-1R介導(dǎo)的下游AKT信號通路受到抑制，表現(xiàn)為AKT磷酸化水平(p-AKT)水平降低(p＜0.05)，而總的AKT水平未受明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.構(gòu)建的miR-let-7a慢病毒載體能有效感染原代睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞，并顯著提高睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞中miR-let-7a的表達(dá)水平。
　　2.過表達(dá)miR-l

9、et-7a能顯著抑制體外培養(yǎng)的睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　3.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-let-7a可以干擾睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞中IGF-1R基因及其蛋白的表達(dá)，并引起IGF-1R下游通路AKT磷酸化水平降低。IGF-1R/AKT通路可能是miR-let-7a抑制睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　綜上所述，microRNA let-7a在睪丸卵黃囊瘤中也發(fā)揮著抑癌基因的作用，可能是通過抑制靶基因I