高血壓病心房顫動患者血尿酸代謝異常及CYP11B2-344T＞C基因多態(tài)性研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　心房顫動（Atrial fibrillation）是臨床最常見的心律失常之一，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國三十歲以上的人群，心房顫動的患病率為0.77％，且該患病率呈現(xiàn)隨年齡增長而逐漸增加的趨勢，其中男性患病率高于女性，但在女性絕經(jīng)期后，男女患病率沒有明顯差異。心房顫動常發(fā)生于某些器質(zhì)性心血管疾病，如高血壓病、冠心病、心肌病、心臟瓣膜病及心力衰竭等，其發(fā)病率增加和心力衰竭患者死亡率增加相關(guān)，最主要危害是卒中。然而

2、，大多數(shù)心房顫動的發(fā)病原因不明。有研究證實14％的心房顫動由高血壓病導(dǎo)致，且高血壓病是新發(fā)心房顫動的獨立預(yù)測因素。
　　臨床上可見某些心房顫動患者血尿酸(Uric acid)值偏高，除合并高血壓外無其他心血管病并存。尿酸是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個與多種心血管疾病發(fā)病率及死亡率有關(guān)的危險因素，作為人體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝的終產(chǎn)物，尿酸如何引起心房顫動發(fā)生，尚不清楚！我們推測高尿酸血癥可影響心房肌小動脈血管內(nèi)皮細胞功能，導(dǎo)致血管舒張能力下降，血

3、管持續(xù)收縮，引起局部心肌發(fā)生缺血性改變及纖維化，進而導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)改變及心房顫動發(fā)生。而動脈血管舒張功能和血管內(nèi)皮細胞合成的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)關(guān)系密切，eNOS可催化L-精氨酸生成一氧化氮(NO)，而NO有強大的血管舒張作用。當eNOS表達水平下降時，NO減少將會使血管舒張功能受到影響。此外，醛固酮合酶CYP11B2基因多態(tài)性將會影響腎功能，導(dǎo)致尿酸排泄障礙，從而引發(fā)高尿酸血癥。據(jù)此認為，高血壓病患者心房顫動的發(fā)生可能與血尿酸

4、代謝異常及醛固酮合成酶CYP11B2-344T＞C基因多態(tài)性有關(guān)。為驗證上述假設(shè)，本研究將通過臨床病例回顧性分析、用不同濃度尿酸干預(yù)人類動脈血管內(nèi)皮細胞觀察其對于eNOS表達水平的影響及CYP11B2-344T＞C基因多態(tài)性對心房顫動易感性影響的薈萃分析，多角度探討高血壓病患者心房顫動發(fā)生的相關(guān)因素及可能機制。
　　研究方法:
　　一、病例資料回顧性分析研究
　　1.選擇2010年1月至2014年12月在我院心內(nèi)科住院

5、的高血壓病患者為研究對象，所有患者均符合中國高血壓防治指南制定的高血壓病診斷標準，心房顫動以經(jīng)體表12導(dǎo)聯(lián)心電圖或24小時動態(tài)心電圖診斷為標準。并以此分為高血壓病合并心房顫動組與高血壓病對照組。
　　2.排除標準為:合并冠心病、繼發(fā)性高血壓、心臟瓣膜病、先心病、心肌病、心力衰竭、心臟手術(shù)后、糖尿病、家族性血脂異常、甲狀腺功能異常、血清肌酐大于110μmol/L、重度感染性疾病、自身免疫性疾病或炎癥性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病及應(yīng)用影響尿酸

6、代謝藥物（利尿劑除外）的患者。
　　3.查閱電子病歷數(shù)據(jù)庫，完整記錄所有入選患者的基本信息、臨床基本指標及相關(guān)輔助檢查結(jié)果，進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　二、尿酸對人動脈血管內(nèi)皮細胞功能影響及機制研究
　　1.應(yīng)用不同濃度尿酸(400 umol/L，600 umol/L，800 umol/L，1000 umol/L)作用于人冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，應(yīng)用Real-time-PCR和Westernblot檢測不

7、同濃度尿酸作用下eNOS mRNA和蛋白表達水平的變化，從而篩選出最適合的尿酸濃度。并以此尿酸濃度作用于兩種人血管內(nèi)皮細胞，應(yīng)用Real-time-PCR和Western blot方法在不同時間點檢測eNOS mRNA和蛋白表達水平變化，從而選出變化最明顯的時間點進行實驗。
　　2.用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D預(yù)處理人血管內(nèi)皮細胞，再以尿酸進行干預(yù)，應(yīng)用Real-time PCR在不同時間點檢測eNOS mRNA表達水平，以判斷尿酸對R

8、NA穩(wěn)定性的影響。
　　3.用eNOS特異性抑制劑L-NAME預(yù)處理人血管內(nèi)皮細胞，再用尿酸進行干預(yù)，MTT方法檢測內(nèi)皮細胞增殖情況，以判斷尿酸對內(nèi)皮細胞增殖的影響是否直接與eNOS有關(guān)。
　　4.用Western blot方法分別檢測不同時間點(10min，20min，30min，40min)經(jīng)尿酸作用的人血管內(nèi)皮細胞MAPKs(P38 MAPK， JNK MAPK， ERK MAPK)通道是否有激活，判斷不同血管內(nèi)皮細胞

9、是否被激活的MAPKs通道種類及激活時間不同。
　　5.應(yīng)用P38 MAPK通道特異性藥物抑制劑(SB203580)預(yù)處理人冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞，然后加入尿酸，通過Real-time PCR的方法檢測eNOS mRNA表達水平變化，判斷尿酸對eNOS mRNA表達水平的調(diào)節(jié)是否通過P38 MAPK通道激活實現(xiàn)的。應(yīng)用腺病毒負性突變體P38-DN-Adv轉(zhuǎn)染人冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞后再加入尿酸，通過Western blot方法檢測eN

10、OS蛋白表達水平的變化，判斷尿酸對eNOS蛋白表達水平的調(diào)節(jié)是否通過P38 MAPK通道激活實現(xiàn)的。
　　6.PGL2-eNOS(-331/+109)-Firefly luciferase reporter質(zhì)粒和pGL2-β-Actin-Renilla luciferase共轉(zhuǎn)染HCAEC細胞后，加入600 umol/L尿酸繼續(xù)培養(yǎng)，雙熒光報告基因系統(tǒng)檢測尿酸是否影響eNOS啟動子的活性，判斷尿酸是否在轉(zhuǎn)錄前水平調(diào)節(jié)eNOS基因表

11、達。
　　7.用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子GATA-4與eNOS啟動子的結(jié)合情況，以判斷尿酸是否對該結(jié)合狀況有影響。
　　8.通過大鼠腹腔動脈血管環(huán)實驗檢測尿酸對動脈血管舒張功能的影響，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　三、CYP11B2-344T＞C基因多態(tài)性與高血壓病心房顫動發(fā)生的相關(guān)性
　　1.通過病例-對照研究進行Meta分析，探討CYP11B2-344T＞C基因多態(tài)性和心房顫動易感性的關(guān)系。
　　2.

12、應(yīng)用統(tǒng)計軟件計算等位基因模型，純合子模型，隱性模型和顯性模型的優(yōu)勢比(OR)和95％可信區(qū)間(CI)，并通過固定效應(yīng)和隨機效應(yīng)模型評估二者的關(guān)聯(lián)性。
　　3.根據(jù)異質(zhì)性來源的不同進行亞組分析，最后達到應(yīng)用單一原因?qū)τ诳傮w結(jié)果進行評價，并對文章的發(fā)表偏倚進行評估。
　　研究結(jié)果:
　　1.研究發(fā)現(xiàn)高血壓病患者血尿酸水平升高與心房顫動的發(fā)生密切相關(guān)
　　(1)本研究共納入940例患者，其中高血壓病合并心房顫動患者36

13、2例，高血壓病不合并心房顫動患者578例（對照組）。兩組患者的性別、白細胞值、血鉀值、肌酐值、收縮壓、舒張壓、左心室后壁厚度及室間隔厚度與心房顫動發(fā)生的風險均無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。與對照組比較，高血壓病合并心房顫動組平均年齡更大（67.13±10.59 vs.56.78±14.92，p＜0.01）、忠高血壓病平均時間更長（9.27±9.50 vs.3.85±3.57，p＜0.01），且血尿酸水平及左心房直徑明顯高于對照組，分別為

14、388.11±112.51 vs.311.54±122.51(p＜0.01)及45.79±7.56 vs.34.08±4.36(p＜0.01)。
　　(2)通過患者年齡、患高血壓病年限、血尿酸水平及左心房直徑對心房顫動發(fā)病風險預(yù)測進行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，心房顫動發(fā)病風險和患者血尿酸值(OR=1.014;95％可信區(qū)間=1.005-1.023，p=0.002)及左心房直徑(OR=1.390;95％可信區(qū)間=1.221-1.

15、582，p＜0.001)具有獨立的相關(guān)性。
　　2.研究發(fā)現(xiàn)尿酸對人動脈血管內(nèi)皮細胞功能產(chǎn)生明顯影響
　　(1)不同濃度尿酸作用于人冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞后檢測結(jié)果顯示:尿酸濃度為600 umol/L和1000 umol/L時，24小時HCAEC細胞eNOSmRNA表達量分別降低39.22％和69.22％(p＜0.01);蛋白表達量分別降低62.10％和65.67％(p＜0.05)。在HUVEC細胞中，當

16、尿酸濃度為600 umol/L和1000 umol/L時，24小時eNOS mRNA表達水平分別下降27.44％和51.87％(p＜0.01);蛋白表達水平分別下降7.21％(p＞0.05)和52.88％(p＜0.01);當尿酸作用達48小時，600umol/L濃度組eNOS蛋白表達量下降40.31％(p＜0.01)。
　　(2)用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D1ug/ul預(yù)處理人血管內(nèi)皮細胞，再用600 umol/L尿酸干預(yù)HCAEC細胞

17、和HUVEC細胞，與無放線菌素D的尿酸組比較，兩種細胞eNOSmRNA降解趨勢無顯著性差別。
　　(3)用eNOS特異性抑制劑L-NAME100uM預(yù)處理人血管內(nèi)皮細胞，再應(yīng)用600umol/L尿酸干預(yù)，與無L-NAME的尿酸組比較，HCAEC和HUVEC細胞增殖趨勢無明顯差異。
　　(4)600 umol/L尿酸作用于HCAEC細胞時，P38 MAPK通道和ERK MAPK通道分別被激活，相同濃度尿酸作用于HUVEC細胞時

18、，被激活的通道是JNK MAPK和ERK MAPK通道。
　　(5)用P38 MAPK通道特異性藥物抑制劑(SB203580)預(yù)處理HCAEC細胞后，加入600 umol/L尿酸，與對照組比較eNOS mRNA表達水平幾乎無變化，表明尿酸降低eNOS mRNA表達的作用被逆轉(zhuǎn)。
　　(6)腺病毒負性突變體P38-DN-Adv轉(zhuǎn)染HCAEC細胞，再加入600 umol/L尿酸，與對照組比較eNOS蛋白表達水平幾乎無變化，表明尿

19、酸降低eNOS蛋白表達的作用被逆轉(zhuǎn)。
　　(7)PGL2-eNOS(-331/+109)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCAEC細胞后，加入600 umol/L尿酸繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，檢測細胞eNOS啟動子活性較無尿酸對照組下降43.58％(p＜0.01)。
　　(8)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測與對照組相比，尿酸使轉(zhuǎn)錄因子GATA-4與HCAEC細胞啟動子的結(jié)合力增強。
　　(9)在內(nèi)皮依賴型緩激肽作用下，對照組大鼠離體腹腔主動脈血管環(huán)發(fā)生舒

20、張。作為陰性對照組的L-NAME組動脈血管環(huán)舒張幅度明顯減弱，和對照組相比，尿酸組動脈血管環(huán)的舒張幅度減弱48.53％(p＜0.01)。
　　3.通過9項病例對照研究證實，在高血壓病人群中，CYP11B2-344T＞C多態(tài)性明顯與心房顫動易感性顯著相關(guān)（等位基因模型:OR=1.18，95％ CI=1.04-1.33，p＜0.01;純合子模型:OR=1.54，95％ CI=1.17-2.03，p＜0.01;隱性模型:OR=1.70，

21、95％ CI=1.24-2.32, p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.初步闡明了尿酸代謝異常促發(fā)高血壓病患者心房顫動發(fā)生的作用及可能機制。即尿酸通過下調(diào)HCAEC細胞eNOS mRNA和蛋白表達水平，影響動脈血管舒張功能，使血管持續(xù)收縮，進而導(dǎo)致局部心房肌發(fā)生缺血性變化及纖維化，成為心房顫發(fā)生的因素。
　　2.從臨床和基礎(chǔ)研究兩個方面均證實了血尿酸水平與心房顫動發(fā)生密切相關(guān)，這種相關(guān)性在高血壓病合并心房顫動患者中表