耐萬(wàn)古霉素腸球菌檢測(cè)基因芯片方法的建立和驗(yàn)證.pdf

1、腸球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性球菌，它廣泛分布于自然環(huán)境及人和動(dòng)物的消化道內(nèi)，其致病力較弱，只有在宿主組織寄殖，耐機(jī)體非特異及免疫防御機(jī)制，并引起病理改變才能導(dǎo)致感染。但是由于近年來(lái)在臨床中廣譜抗生素尤其是萬(wàn)古霉素的大量使用以及在使用中的不合理現(xiàn)象，導(dǎo)致了耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)的出現(xiàn)，從而引起了全世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。近年來(lái)大量研究顯示，由于VRE更容易引起院內(nèi)感染及播散，其檢測(cè)、鑒別與診斷也成為了醫(yī)務(wù)工作者及研究者們所面臨的重要問(wèn)題。目前常

2、用VRE的檢測(cè)方法為細(xì)菌學(xué)方法，其使用耗時(shí)且無(wú)法準(zhǔn)確辨別腸球菌的菌種類(lèi)型;并且腸球菌屬中不同種細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性存在差異，其也無(wú)法區(qū)分VRE的耐藥基因。相對(duì)于藥敏實(shí)驗(yàn)的不足，本研究選取了2種常見(jiàn)的腸球菌，旨在應(yīng)用基因芯片檢測(cè)技術(shù)研制可以區(qū)分VRE種類(lèi)及耐藥基因型的基因芯片，為深入開(kāi)展基因芯片檢測(cè)VRE更廣泛應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。我們以16S rDNA基因作為檢測(cè)靶片段，耐萬(wàn)古霉素特異性基因及腸球菌的特異性基因作為靶序列，根據(jù)GeneB

3、ank中查找到的2種常見(jiàn)腸球菌特異性基因序列（ddl）及萬(wàn)古霉素耐藥基因（VanA，VanB），利用BLAST等比對(duì)軟件，設(shè)計(jì)與合成用于檢測(cè)腸球菌的特異性基因及耐藥基因的引物和探針，制備耐萬(wàn)古霉素腸球菌檢測(cè)基因芯片。利用多重不對(duì)稱PCR法擴(kuò)增樣品中的特異性基因與耐藥基因片段，標(biāo)記產(chǎn)物與基因芯片上的探針雜交，經(jīng)清洗、化學(xué)發(fā)光法顯色后進(jìn)行結(jié)果分析。在優(yōu)化的多重PCR體系、雜交反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條件下，評(píng)價(jià)芯片的特異性、靈敏性和重復(fù)性等性能

4、指標(biāo)，并應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)。最后本研究所選取的靶耐藥基因和腸球菌特異性基因?yàn)槟腿f(wàn)古霉素A基因（VanA）、耐萬(wàn)古霉素B基因（VanB）、腸球菌特異性基因(ddl)，16S rDNA基因作為內(nèi)對(duì)照，共篩選出1對(duì)通用引物、4對(duì)特異性引物和1條細(xì)菌通用探針、4條特異性檢測(cè)探針。確定了五重PCR體系。確定了每種探針的cutoff值。檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌的靈敏度為103cfu/mL，批間和批內(nèi)變異系數(shù)CV值均小于15％。對(duì)40例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)