萬古霉素敏感性下降金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制研究及萬古霉素聯(lián)合治療方案探索.pdf

1、目的:
　　萬古霉素敏感性下降金黃色葡萄球菌包括萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌(Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus，VISA)、異質(zhì)性萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌(Heterogeneous Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus，hVISA)以及耐受性菌株。這些菌株往往與萬古霉素(Vancomycin，VAN)治療效果不

2、佳有關(guān)，同時對二次治療更加耐藥。VAN治療失敗的問題備受臨床關(guān)注，積極探索防止這類菌株出現(xiàn)及傳播的策略、明確其分子生物學(xué)耐藥機(jī)制以及尋找有效的治療方案十分必要。
　　方法:
　　選取Mu3(VAN MIC=2mg/L)作為研究菌株，將其暴露在不同的抗菌藥物環(huán)境中，進(jìn)行為期28天的體外誘導(dǎo)耐藥。抗菌藥物暴露方案為VAN單藥，VAN聯(lián)合頭孢唑啉(Cefazolin，CFZ)、磷霉素(Fosfomycin，F(xiàn)OF)、慶大霉素(Ge

3、ntamicin，GEN)、美羅培南(Meropenem，MEM)、利福平(Rifampin，RIF)、哌拉西林他唑巴坦(Piperacillin-Tazobactam，TZP)以及磺胺甲惡唑/甲氧芐啶(Trimethoprim-Sulfamethoxazole，SXT)。對Mu3和經(jīng)體外誘導(dǎo)出的菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性測定，并檢測細(xì)胞壁厚度、類胡蘿卜素含量及膜流動性。然后對Mu3及所有誘導(dǎo)出的菌株進(jìn)行全基因組測序?；蚪MDNA的提取由J

4、ANUS自動化工作站完成。DNA文庫的制備應(yīng)用NextEra XTDNA提取試劑盒制備。全基因組測序在NexSeg儀器進(jìn)行，測長2*150bp。最后通過體外藥代動力學(xué)/藥效動力學(xué)(Pharmacokinetic/Pharmacodynamics，PK/PD)模型實驗，通過高精度色譜泵模擬不同藥物的半衰期，運行48小時，評價VAN聯(lián)合待測3種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物對hVISA菌株——Mu3的體外抗菌活性，并設(shè)定β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的給藥頻次

5、為每24小時一次，每12小時一次和每8小時一次，以觀察不同的給藥頻次在與VAN聯(lián)合應(yīng)用時的殺菌作用。分別在第0、1、2、4、6、8、12、24、26、28、32和48h從模型中采樣進(jìn)行菌落計數(shù)，繪制時間殺菌曲線，通過計算時間殺菌曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)來比較抗菌藥物的殺菌作用。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)過28天的體外抗菌藥物暴露，VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物僅使VAN MIC上升至2-4mg

6、/L，其中VAN+CFZ和VAN+TZP聯(lián)合用藥組最為有效，VAN MIC僅為2mg/L。Mu3暴露于其他抗菌藥物組合，除了VAN+FOF，在第7天時均能阻止VAN MIC的上升，但是從第二周開始就不再表現(xiàn)出抑制VAN MIC上升的作用，使VAN MIC上升至4-16mg/L。細(xì)胞壁厚度與VAN MIC呈正相關(guān)(R2=0.939)。對比經(jīng)VAN單藥誘導(dǎo)出的菌株，經(jīng)VAN+β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物誘導(dǎo)出的菌株的細(xì)胞壁厚度明顯減小，而經(jīng)VAN聯(lián)

7、合非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物誘導(dǎo)出的菌株細(xì)胞壁厚度明顯增厚。類胡蘿卜素含量(R2=0.267)和膜流動性(R2=0.680)與VAN MIC之間無相關(guān)性。
　　對全部25株菌株進(jìn)行全基因組測序共檢測到60個獨立的變異位點，包括51個單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，3個基因插入和6個基因缺失。經(jīng)VAN+CFZ誘導(dǎo)耐藥的菌株與母代菌株Mu3比對無任何基因突變發(fā)生。只有經(jīng)VAN+RIF

8、誘導(dǎo)耐藥的菌株發(fā)生了rpoB突變(3/24)，為A471G和H481N。pbp2突變?nèi)勘憩F(xiàn)在經(jīng)VAN+MEM誘導(dǎo)出的菌株中(3/24)(S499Y，P505T，G631R，G631V)，而mecA突變G487D，G574D均由VAN+TZP誘導(dǎo)出(3/24)。rpoC突變(7/24)在經(jīng)VAN單藥(3/3，L1150H)、VAN+SXT聯(lián)合暴露(3/3，L1150H，D1160V和R967G)和VAN+MEM聯(lián)合暴露(1/3，V669

9、L)誘導(dǎo)的菌株中均有發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)為多態(tài)性。walR突變僅由VAN+FOF(1/24)誘導(dǎo)產(chǎn)生的;walK突變發(fā)生在經(jīng)VAN+GEN(2/3)、VAN+SXT(1/3)和VAN+RIF(1/3)誘導(dǎo)的菌株中，也表現(xiàn)出多態(tài)性(S584I，A243T，I183K，V383I)。4/24的菌株檢測出vraG突變，分別為分布在經(jīng)VAN+GEN(1/3)、VAN+SXT(2/3)和VAN+FOF(1/3)誘導(dǎo)的菌株中，也表現(xiàn)為多態(tài)性。僅有2/24菌株

10、被誘導(dǎo)出mprF突變(S295L，S337T)，分別由VAN+RIF和VAN+FOF誘導(dǎo)出。
　　在體外PK/PD模型實驗中，VAN單藥組在24小時時表現(xiàn)出了對Mu3的殺菌活性，但是從32小時到48小時出現(xiàn)了細(xì)菌再生長，所有的待測β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物對Mu3均未顯示出殺菌活性。在聯(lián)合用藥模型中，除了VAN+CFZ組在12小時時顯示了對Mu3的殺菌活性，VAN+MEM組和VAN+TZP組均在8小時時表現(xiàn)出了對Mu3的殺菌活性。對比V

11、AN單藥組，在所有的VAN+β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的聯(lián)合用藥方案中，無論何種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，無論β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的給藥頻次如何均未見細(xì)菌再生長。對比VAN單藥組，VAN+β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物聯(lián)合用藥方案在達(dá)到殺菌活性的時間(P＜0.005)和AUC(P＜0.001)兩方面均表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺菌活性，具有顯著差異。在所有聯(lián)合用藥方案中，VAN+MEM組和VAN+TZP組的AUC明顯小于VAN+CFZ組(P＜0.01)。在所有的VAN聯(lián)

12、合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的方案中，變換β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的給藥頻次，對Mu3的殺菌活性無論是在達(dá)到殺菌作用的時間還是AUC均沒有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　該研究清楚地表明，在體外VAN聯(lián)合治療能顯著地影響hVISA向VISA轉(zhuǎn)變。但只有VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物有效的抑制了VAN耐藥的發(fā)展。鑒于VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有抑制VAN耐藥的作用，該聯(lián)合用藥方案作為治療嚴(yán)重MRSA感染的長期治療方案還應(yīng)做進(jìn)一步的探討

13、。VAN單藥及VAN+GEN、VAN+SXT、VAN+RIF和VAN+FOF在體外誘導(dǎo)出的菌株雖都為VISA表型，但決定其表型的基因通路卻各有差異。VAN+CFZ聯(lián)合用藥抑制了VISA表型發(fā)展的基因通路，阻止了hVISA向VISA轉(zhuǎn)變。在體外PK/PD模型中，VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物顯示出了協(xié)同作用。在與VAN聯(lián)合用藥時，同種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物不同的給藥頻次之間對Mu3的殺菌作用無明顯差異。故在VAN與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物聯(lián)合用