嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜屏障損傷的機(jī)理及防治研究.pdf

1、一、研究背景：
　　機(jī)體正常的腸粘膜屏障主要由機(jī)械、免疫及生物屏障三部分構(gòu)成，機(jī)械屏障是由腸黏膜上皮細(xì)胞的緊密連接形成的，可阻止細(xì)菌和內(nèi)毒素的侵入;免疫屏障是腸粘膜淋巴組織形成的，通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫作用，阻止致病性抗原對(duì)機(jī)體的傷害;生物屏障是由腸道菌群與腸黏膜緊密結(jié)合形成的，可阻止腸道中條件致病菌的定植和入侵。在正常情況下，由于胃腸道黏膜屏障的保護(hù)作用，機(jī)體免受腸腔內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素的侵襲。而在嚴(yán)重?zé)齻蟮募毙詰?yīng)激反應(yīng)條件下，由于

2、血液的重新分配，腸道極易缺血缺氧。胃腸粘膜由于急性的缺血缺氧導(dǎo)致腸黏膜屏障受到破壞，引發(fā)細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位，從而導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位到血液循環(huán)即腸源性感染的發(fā)生。這也是導(dǎo)致燒傷后SIRS和MODS發(fā)生的重要因素。因此，嚴(yán)重?zé)齻蠓乐文c黏膜屏障的損傷就成為了燒傷研究的熱點(diǎn)之一。目前針對(duì)嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)械屏障和免疫屏障損害的機(jī)理已有較多研究，但是關(guān)于生物屏障損害機(jī)理的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察大鼠嚴(yán)重燙傷后腸道菌群發(fā)生的變化，從而了解腸黏膜生物

3、屏障損害的情況，提出針對(duì)性的防治策略;本課題還根據(jù)嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜三個(gè)屏障損傷發(fā)生的機(jī)制，早期喂養(yǎng)對(duì)三個(gè)屏障均有保護(hù)作用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而證實(shí)嚴(yán)重?zé)齻∪嗽缙谖桂B(yǎng)混合營(yíng)養(yǎng)劑有助于保護(hù)腸粘膜屏障的完整性。
　　二、研究目的：
　　1.通過(guò)對(duì)嚴(yán)重燙傷大鼠的糞便16S rRNA宏基因組測(cè)序，研究嚴(yán)重燙傷后大鼠腸道生物屏障的變化。2.探討早期口服混合腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)嚴(yán)重?zé)齻∪四c黏膜屏障的保護(hù)及修復(fù)作用。
　　三、資料和方法：

4、>　　1.第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供SD大鼠10只，體重(200～220)g，10只大鼠在燙傷前3天，給予正常喂養(yǎng)（飲水和食物），未予其他處理。分別于燙傷前和燙傷后的前三天，無(wú)菌鑷子收集新鮮糞便于無(wú)菌便盒內(nèi)，分別標(biāo)記為燙傷前和燙傷后。后提取燙傷前后各組糞便DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA(V3-V4)區(qū)，運(yùn)用高通量Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因測(cè)序。具體測(cè)序內(nèi)容如下:①大鼠腸道菌群OTU（操作分類(lèi)單元）聚類(lèi):根據(jù)序列之間97％的相似性作為閾

5、值，分成OTU來(lái)分析微生物的多樣性。②物種分類(lèi):采用RDP classifier對(duì)每條序列在門(mén)、綱、目、科、屬水平上進(jìn)行物種分類(lèi)，覆蓋率（其數(shù)值越高，則樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率越低）80％為閾值對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類(lèi)進(jìn)行序列豐度（數(shù)量）計(jì)算，構(gòu)建樣本和物種分類(lèi)單元序列豐度矩陣。③Alpha多樣性的分析:計(jì)算組內(nèi)各樣本的物種多樣性(Richness index、Shannon index、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù))，衡量樣本物種

6、多樣性。④Beta多樣性分析:分析樣品間的差異，選取具有代表性的序列與16S rRNA的關(guān)鍵序列進(jìn)行比較，依照多序列隊(duì)列構(gòu)建具有代表性的序列作為節(jié)點(diǎn)的發(fā)育樹(shù)，運(yùn)用Unifrac metric加權(quán)重（計(jì)算不僅評(píng)估樣本間物種的差異，并且加入了物種豐度（數(shù)量）作為權(quán)重）方式來(lái)衡量樣品間的距離、樣品的聚類(lèi)樹(shù)及樣品的PCA。統(tǒng)計(jì)運(yùn)用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析。
　　2.選擇第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所2013年8月至2014年

7、9月收治且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的24例燒傷病人，隨機(jī)將病人分為常規(guī)治療組和早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組，每組各12例。常規(guī)治療組病人于傷后24 h內(nèi)起接受常規(guī)治療，早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組于相同時(shí)相點(diǎn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上口服含有谷氨酰胺、益生菌、益生元的混合腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑100mL，連續(xù)喂養(yǎng)7天。分別于入院時(shí)及喂養(yǎng)后第1日、第3日、第7日、第14日、第21日檢測(cè)病人血清二胺氧化酶(DAO)、血清降鈣素原(PCT)，血漿內(nèi)毒素(LPS)水平及創(chuàng)面分泌物和血液微生物學(xué)培養(yǎng)，觀察傷

8、后21日內(nèi)有無(wú)發(fā)生MODS。統(tǒng)計(jì)運(yùn)用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)行Fisher確切概率法、LSD-t檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量方差分析及秩和檢驗(yàn)。
　　四、結(jié)果：
　　1.嚴(yán)重燙傷后大鼠腸道生物屏障變化的研究:①OTU（操作分類(lèi)單元）聚類(lèi)分析:大鼠燙傷前后腸道菌群的OTU結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均大于0.05）。說(shuō)明燙傷前后大鼠腸道菌群的種類(lèi)組成沒(méi)有發(fā)生改變。②物種分類(lèi):燙傷前后大鼠腸道菌群的種類(lèi)豐度（數(shù)量）有明顯差異。其中有益菌厚壁菌門(mén)數(shù)

9、量相比較燙傷前明顯減少，致病菌變形菌門(mén)數(shù)量相比較燙傷前明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.05）。說(shuō)明燙傷后腸道有益菌種數(shù)量減少，致病菌種數(shù)量增多。③Alpha多樣性分析:燙傷前和燙傷后兩組樣品組內(nèi)相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均大于0.05）。說(shuō)明兩組樣品均具有良好的多樣性，也證明了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。④Beta多樣性分析:燙傷前后兩組樣品組間各自形成聚類(lèi)，具有各自的特征。說(shuō)明燙傷后腸道菌群多樣性發(fā)生了變化，且改變主要體現(xiàn)在物種豐度

10、（數(shù)量）方面。
　　2.嚴(yán)重?zé)齻缙诳诜c內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)腸黏膜屏障保護(hù)的臨床研究
　?、傺錎AO水平:早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人于喂養(yǎng)后第7日、第14日及第21日血清DAO水平均明顯低于常規(guī)治療組（P值均小于0.05）:其余時(shí)相點(diǎn)組間結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均大于0.05）。②血清PCT水平:早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人于喂養(yǎng)后第7日、第14日血清PCT水平均明顯低于常規(guī)治療組（P值小于0.05或P值小于0.01）;其余時(shí)相點(diǎn)組間結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義（P值均大于0.05）。③血漿LPS水平:早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人血漿LPS水平于喂養(yǎng)后第7日明顯低于常規(guī)治療組（P值小于0.05）;其余時(shí)相點(diǎn)組間結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均大于0.05）。④血液和創(chuàng)面微生物培養(yǎng):常規(guī)治療組和早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組血液細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)呈陽(yáng)性結(jié)果分別有7例、1例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值小于0.05），且常規(guī)治療組有2例培養(yǎng)出腸道常駐菌。兩組病人創(chuàng)面微生物培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值大于0.05）。⑤MODS發(fā)

12、生情況:常規(guī)治療組病人有1例發(fā)生MODS，而早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人中未發(fā)生MODS。組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值大于0.05)。
　　五、結(jié)論：
　　1.嚴(yán)重燙傷后大鼠腸道菌群的種類(lèi)組成沒(méi)有發(fā)生改變，但有益菌厚壁菌門(mén)的數(shù)量相比較燙傷前明顯減少，致病菌變形桿菌門(mén)的數(shù)量較燙傷前明顯增多，表明大鼠嚴(yán)重燙傷后發(fā)生了腸道菌群紊亂，腸黏膜的生物屏障受損。2.嚴(yán)重?zé)齻∪嗽缙诩佑没旌夏c內(nèi)喂養(yǎng)劑，可保護(hù)和修復(fù)腸黏膜屏障的功能，減輕炎癥反應(yīng)，從