模擬失重對(duì)大鼠腸黏膜機(jī)械屏障與免疫屏障的影響.pdf

1、人類對(duì)外層空間的探索以及太空資源的開(kāi)發(fā)和利用帶來(lái)航天活動(dòng)的蓬勃發(fā)展。近年來(lái)，我國(guó)的航天事業(yè)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。但航天事業(yè)的發(fā)展離不開(kāi)航天醫(yī)學(xué)的支持。 航天器圍繞地球旋轉(zhuǎn)時(shí)，處于失重狀態(tài)。但由于受到殘余大氣阻力、航天器自旋等因素影響，其內(nèi)部表現(xiàn)為微重力環(huán)境。微重力環(huán)境對(duì)已適應(yīng)地球重力影響的哺乳動(dòng)物生物機(jī)能的影響，會(huì)阻礙人類的空間探索，因此已成為空間生命科學(xué)與空間細(xì)胞生物科學(xué)的研究熱點(diǎn)。失重對(duì)生物機(jī)體的研究，最好將生物體置于宇宙空間飛

2、行真實(shí)失重環(huán)境中進(jìn)行。但由于航天飛行的載荷量低，空間狹小，成本高，大量的相關(guān)研究工作基本為地面模擬失重狀態(tài)下進(jìn)行。模擬失重的大鼠動(dòng)物模型一般采用尾懸吊法。實(shí)驗(yàn)大鼠尾部懸于籠頂30°，前肢踏于籠底，可自由活動(dòng)。此模型可以較理想地模擬失重條件下體液移動(dòng)和制動(dòng)的效果，是一種較好的失重模擬方法， 幾十年的航天實(shí)踐及模擬失重研究證實(shí)，空間飛行會(huì)導(dǎo)致心血管功能障礙、骨質(zhì)丟失、肌肉萎縮、免疫能下降、內(nèi)分泌功能紊亂及空間運(yùn)動(dòng)病等多種生理和病理變

3、化，研究也取得了很大的成果。但是對(duì)消化系統(tǒng)失重生理病理學(xué)的研究卻十分局限，迄今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)失重和模擬失重環(huán)境下腸道黏膜屏障的研究報(bào)道。 胃腸道除作為消化吸收的器官，完成食物的消化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及廢物的排泄外，由于腸道內(nèi)存在眾多的化學(xué)物質(zhì)和大量的微生物，為避免這些外來(lái)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損害，胃腸道還有一套完整的防御體系，即胃腸道的粘膜屏障功能。該屏障由粘膜機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學(xué)屏障四個(gè)層次構(gòu)成。腸黏膜上皮細(xì)胞及其緊密連

4、接是粘膜機(jī)械屏障的重要組成部分，它的完整性是黏膜屏障的基礎(chǔ)。在腸道免疫中sIgA扮演著重要角色，它主要由腸粘膜固有層中的IgA漿細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)發(fā)生腸粘膜上皮受損時(shí)，勢(shì)必影響到sIgA的分泌，削弱機(jī)體的免疫屏障功能。腸道淋巴樣系統(tǒng)由具有分化功能并能產(chǎn)生局部免疫的淋巴細(xì)胞亞群所組成，參與免疫調(diào)節(jié)。任何原因造成免疫功能受損，均可引起腸粘膜免疫屏障功能減弱。 本研究依據(jù)目前航天醫(yī)學(xué)的現(xiàn)狀而設(shè)立課題，進(jìn)行模擬失重動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察微重力環(huán)境對(duì)腸

5、黏膜機(jī)械及免疫屏障的的影響。 研究方法：(1)選用清潔級(jí)成年健康雄性Wistar大鼠，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。依照陳杰等設(shè)計(jì)的尾懸吊法(tail-suspension)建立模擬失重大鼠模型。各時(shí)相點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)將實(shí)驗(yàn)及對(duì)照動(dòng)物麻醉，無(wú)菌操作，剖腹取材。(2)實(shí)驗(yàn)一：Wistar大鼠，隨機(jī)分為5組：模擬失重lw組、模擬失重2w組、模擬失重3w組、模擬失重4w組以及地面對(duì)照組。酶法檢測(cè)血中D-乳

6、酸的變化水平，鱟試劑法測(cè)定門靜脈內(nèi)毒素水平，透射電鏡觀察回腸黏膜的超微結(jié)構(gòu)變化。(3)實(shí)驗(yàn)二：Wistar大鼠，隨機(jī)分為模擬失重組和對(duì)照組，分別設(shè)1d、2d、4d、及7d共4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定TNF-α的水平，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腸道黏膜NF-kB表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡。(4)實(shí)驗(yàn)三：Wistar大鼠，隨機(jī)分為模擬失重組和對(duì)照組，1d、2d、4d及7d不同的時(shí)相點(diǎn)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腸黏膜sI

7、gA的表達(dá)，TUNEL法原位檢測(cè)腸黏膜下淋巴細(xì)胞的凋亡，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腸黏膜CD4細(xì)胞數(shù)量的變化。(5)實(shí)驗(yàn)四：在模擬失重下，分6h，12h，24h，48h，96h不同時(shí)相點(diǎn)，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)大鼠黏膜上皮Hsp70的表達(dá)。 結(jié)果：(1)模擬失重對(duì)大鼠的腸壁超微結(jié)構(gòu)破壞明顯，表現(xiàn)為微絨毛排列紊亂脫落，外觀極不平整，細(xì)胞間隙明顯增寬，細(xì)胞橋粒連接模糊。線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、空泡變性。以1W組明顯。模擬失重1w組大鼠的血乳酸水平明顯增

8、高，然后逐漸下降。模擬失重4w組的血乳酸水平接近對(duì)照組水平。模擬失重lw組大鼠的門靜脈血內(nèi)毒素的水平明顯增高，然后略有下降。3w、4w組的內(nèi)毒素水平仍處高水平。(2)模擬失重狀態(tài)下，血漿TNF-a的水平從第2d開(kāi)始升高，4d最高，7d恢復(fù)到正常水平。1d組腸道黏膜NF-kB表達(dá)陽(yáng)性率較對(duì)照組開(kāi)始升高，2d、4d、7d陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，7d模擬失重組的陽(yáng)性表達(dá)仍在高水平。黏膜上皮細(xì)胞的凋亡1d明顯增加，以后開(kāi)始減慢，但7d后仍高于對(duì)照

9、組。(3)模擬失重1d、2d組大鼠腸道黏膜sIgA分泌明顯下降，4d開(kāi)始明顯上調(diào)、7d組slgA的分泌量增多，但仍未恢復(fù)正常水平。模擬失重1d、2d組腸道黏膜的淋巴細(xì)胞凋亡明顯，模擬失重4d、7d組凋亡率明顯下降，逐漸恢復(fù)正常水平。模擬失重1d組腸道黏膜CD4細(xì)胞的數(shù)量明顯下降，模擬失重2d、4d開(kāi)始逐漸上升、7d組CD4細(xì)胞的數(shù)量接近正常水平。(4)模擬失重大鼠從6h開(kāi)始腸黏膜高度表達(dá)Hsp70，24h達(dá)到高峰，48h略有下降，96h

10、仍處在高表達(dá)的水平。 結(jié)論：(1)血D-乳酸和門靜脈內(nèi)毒素濃度的增高，提示模擬失重造成了大鼠腸道黏膜通透性的增加。(2)模擬失重造成了腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的改變和黏膜上皮細(xì)胞的凋亡增加，這可能是黏膜通透性改變的基礎(chǔ)。(3)模擬失重引起大鼠腸道黏膜NF-kB應(yīng)激活化和血漿TNF-α的增高，提示炎性反應(yīng)在失重狀態(tài)下的腸道黏膜損害中起到一定作用。(4)模擬失重造成了大鼠腸道黏膜sIgA的分泌減少，淋巴細(xì)胞的凋亡增加，CD4細(xì)胞數(shù)量的減少，顯