缺血再灌注條件下BMP2-4參與腸黏膜屏障損傷的研究.pdf

1、研究背景:
　　腸道缺血再灌注損傷是一種常見的病理生理過(guò)程，許多疾病的病程中都會(huì)不同程度地伴隨缺血再灌注損傷，如腸系膜動(dòng)脈栓塞、絞窄疝、充血性心力衰竭、嚴(yán)重創(chuàng)傷、失血性休克等，一些手術(shù)及臨床操作也可能導(dǎo)致缺血再灌注損傷，如大血管手術(shù)、小腸移植、心肺流轉(zhuǎn)術(shù)及血液透析等。急性腸缺血嚴(yán)重時(shí)可威脅到患者生命導(dǎo)致死亡，其死亡率約為60-80％，近年來(lái)腸缺血的發(fā)生呈不斷增加的趨勢(shì)，因此深入了解腸道缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，有助于減輕缺血再灌注

2、損傷。
　　腸道缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制目前不甚清楚，相關(guān)學(xué)者先后提出氧自由基損傷、白細(xì)胞黏附與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子和細(xì)胞凋亡等一系列學(xué)說(shuō)，而這些學(xué)說(shuō)與缺血再灌注時(shí)NF-κB信號(hào)的激活從而導(dǎo)致各種損害因子的出現(xiàn)有著重要的聯(lián)系，NF-κB是參與炎癥基因（如黏附分子、細(xì)胞因子、酶等）表達(dá)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與分化、氧化應(yīng)激反應(yīng)等諸多生物過(guò)程的一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。腸黏膜屏障功能的損害包括缺血再灌注時(shí)各種炎癥介質(zhì)的釋

3、放所導(dǎo)致的腸黏膜上皮通透性增加，還包括缺血再灌注時(shí)腸上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白等物理屏障損害導(dǎo)致的細(xì)胞間隙增加，從而造成細(xì)菌及腸道的有害物質(zhì)進(jìn)入到血液中引起嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)。
　　目的：本文就是圍繞缺血再灌注時(shí)NF-κB信號(hào)激活及緊密連接蛋白破壞這一問(wèn)題而展開研究的。
　　方法:
　　1.制作腸上皮細(xì)胞缺氧模型及大鼠腸缺血再灌注損傷模型，腸上皮細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)6小時(shí)后(1％O2，5％CO2)，加入裂解液提取蛋白

4、。1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，常規(guī)脫毛備皮后，取腹部正中切口，沿腹白線剪開腹膜，用血管夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈20分鐘，松開血管夾恢復(fù)血管灌注1小時(shí)后處死大鼠，取上段空腸制作切片。Western-bolt、免疫熒光檢測(cè)腸上皮細(xì)胞內(nèi)的BMP信號(hào)通路的表達(dá)變化。
　　2.腸上皮細(xì)胞IEC-6接種至培養(yǎng)板內(nèi)，加入外源性BMP2、BMP4蛋白刺激細(xì)胞，同時(shí)加入BMP信號(hào)通路特異性性拮抗劑noggin蛋白，并且大鼠腹腔內(nèi)注射noggin蛋白

5、預(yù)處理30分鐘后再接受缺血再灌注損傷，Sham組及缺血再灌注組作為對(duì)照，Western-bolt、免疫熒光檢測(cè)腸上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)變化。
　　3.RT-PCR檢測(cè)腸上皮細(xì)胞外源性BMP2、BMP4及noggin蛋白刺激后，細(xì)胞內(nèi)TNF-a、IL-6等炎癥基因的表達(dá)變化水平。
　　4.Western-bolt檢測(cè)外源性BMP2、BMP4對(duì)腸上皮細(xì)胞IEC-6內(nèi)AKT信號(hào)及緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)變化的影

6、響。
　　結(jié)果:
　　1.腸上皮細(xì)胞缺氧培養(yǎng)6小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)的BMP2、BMP4與對(duì)照組比較表達(dá)增加，受體BMPRⅠa、BMPRⅡ表達(dá)上調(diào)，同時(shí)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到，腸絨毛內(nèi)的BMP2、BMP4、BMPRⅠa、BMPRⅡ熒光信號(hào)在缺血再灌注后較Sham組明顯增強(qiáng)。
　　2.外源性的BMP2、BMP4可直接激活腸上皮細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到NF-κB發(fā)生磷酸化后轉(zhuǎn)移至核內(nèi)參與調(diào)控，而BMP信號(hào)通路的特異性

7、拮抗劑noggin蛋白可部分逆轉(zhuǎn)NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。動(dòng)物模型內(nèi)缺血再灌注組腸上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)明顯激活，而予noggin蛋白預(yù)處理30分鐘組的大鼠NF-κB信號(hào)激活水平降低。
　　3.外源性BMP2、BMP4可誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞內(nèi)的TNF-a、IL-6的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，noggin蛋白可減少TNF-a、IL-6的產(chǎn)生。
　　4.AKT信號(hào)在加入BMP2、BMP4刺激30分鐘時(shí)磷酸化水平明顯增加，細(xì)胞間緊密連

8、接蛋白o(hù)ccludin在加入BMP2、BMP4培養(yǎng)24小時(shí)后，蛋白表達(dá)水平明顯降低，BMP信號(hào)的特異性拮抗劑noggin蛋白及NF-κB通路的阻斷劑PDTC都可阻止occludin蛋白的減少。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧及缺氧再灌注條件下，腸上皮細(xì)胞內(nèi)的BMP2、BMP4蛋白表達(dá)增加，受體BMPRⅠa、BMPRⅡ表達(dá)上調(diào)。在小腸絨毛組織內(nèi)，BMP2及BMP4在絨毛頂端增加最明顯，而基底及隱窩處增加較弱。
　　2.BMP2