PNPLA3基因單核苷酸多態(tài)性及基因表達與乙肝病毒感染易感性及乙肝相關(guān)肝細胞癌的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第六位，每年有748300新發(fā)病例；死亡原因占第三位，每年有695900死亡病例。我國更是 HCC的高發(fā)區(qū)，HCC患者占全世界的50％以上。每年全球超過50%的 HCC新發(fā)病例發(fā)生在中國。在我國內(nèi)地，最近5年 HCC是位居死因第二位的惡性腫瘤，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）的慢性感染是 HCC最主要的危險因素，近80%

2、-90%HCC患者的HBV指標(biāo)呈陽性。目前我國約有1億的HBV慢性感染者，占全球的1/3，而 HCC占全球一半以上。其中3000萬是活動性乙肝患者。據(jù)推測，HBV慢性感染者中約有25~40%將最終進展為 HCC。HBV感染后可出現(xiàn)不同的疾病轉(zhuǎn)歸，如無癥狀攜帶者（ asymptomatic HBsAg carriers， ASCs）或隱匿性肝炎、急性肝炎、慢性乙型肝炎（ chronic hepatitis B, CHB）、肝硬化（live

3、r cirrhosis，LC）或HCC，這些不同的肝臟疾病譜主要與病毒、環(huán)境和宿主遺傳因素有關(guān)。宿主的遺傳因素如易感基因多態(tài)性，即單核苷酸多態(tài)性（ single nucleotide polymorphism， SNP）也在HCC的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。
　　國內(nèi)外許多研究已報道了一系列和肝癌發(fā)生或乙肝病毒持續(xù)感染相關(guān)的 SNP位點，但是發(fā)現(xiàn)的 HBV-HCC遺傳易感性位點卻較少。脂肪滋養(yǎng)蛋白（patatin-like phos

4、pholipase domain-containing3，PNPLA3）基因在脂肪和肝臟中高表達，具有脂肪水解和合成功能。目前國內(nèi)外有大量研究集中在 PNPLA3基因各位點多態(tài)性與肝病的相關(guān)性分析。如多項研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3 rs738409多態(tài)性參與了很多肝病的疾病進程。此多態(tài)性與酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）、LC有關(guān)，并加劇了慢性丙型肝炎（ chronic hepatitis C, CHC

5、）患者的肝脂肪變和纖維化進程。2013年 Valenti L等發(fā)現(xiàn) PNPLA3 rs2294918與非酒精性脂肪肝（ nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）有關(guān)。Pan Q等研究發(fā)現(xiàn)PNPLA3 rs738408影響CHB的發(fā)生。近期研究發(fā)現(xiàn)PNPLA3 rs738409、rs2281135是LC的危險因素。
　　本研究將探討和揭示 PNPLA3基因多態(tài)性（ rs738408、rs738

6、409、rs2294918、rs2294919和rs2281135）與HBV慢性感染及HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展過程中宿主遺傳易感性發(fā)揮的作用。
　　第一部分：PNPLA3基因單核苷酸多態(tài)性及基因表達的分布特征
　　目的：
　　探討 PNPLA3基因（rs738408、rs738409、rs2294918、rs2294919和rs2281135）5個 SNP位點在我國漢族居民的不同人群中的分布特點和規(guī)律。
　　方法

7、：
　　符合納入條件的研究對象共2410例，分為5個亞組，其中包括健康體檢者370例、HBV自然清除（ NC）者248例、慢性HBV感染（ CIB）者（慢性乙型肝炎（CHB）691例和肝硬化（LC）680例）1371例和HBV相關(guān)性肝癌（HCC）患者421例。采用調(diào)查問卷收集研究對象的一般資料，收集外周靜脈血5ml，提取其DNA，運用美國 SEQUENOM公司MassARRAY時間飛行質(zhì)譜技術(shù)進行基因分型檢測。采用K-W H秩和檢

8、驗或?2檢驗比較5個SNP位點不同基因型在多組間的分布情況，由IBM SPSS22.0統(tǒng)計軟件完成數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1基因分型的檢測成功率均高于97%，說明整個實驗操作過程質(zhì)量控制得當(dāng)，步驟合理。
　　2研究對象的一般特征
　　年齡在各組間均有統(tǒng)計學(xué)差異（0.001485.803,2?? P?）。HCC組年齡最高，平均為57.32±8.96歲；LC組平均年齡為52.70±10.78歲， NC組平均年齡為

9、50.13±15.13歲，健康對照組平均年齡為48.24±14.64歲，年齡依次遞減；CHB組平均年齡為39.93±13.21歲，年齡最低。性別在各組間的分布總的來說有統(tǒng)計學(xué)差異（0.00153.446,2?? P?）。HCC組男性比例最高，為77.6%，高于其他各組；LC組和 CHB組男性比例較高，其中LC組為69.4%，CHB組為67.4%；NC組和健康對照組的男性比例最低，其中NC組為58.5%，健康對照組為55.4%。各組的吸煙

10、率有統(tǒng)計學(xué)差異（0.00143.599,2?? P?），其中HCC組吸煙率高于其他各組，為37.1%；而LC組、CHB組、NC組和健康對照組的吸煙率無統(tǒng)計學(xué)差異（22.5%、22.3%、20.2%和21.4%）。各組的飲酒率亦有統(tǒng)計學(xué)差異（0.00135.325,2?? P?）。HCC組飲酒率高于其他各組，為39.0%；而 LC組、CHB組、NC組和健康對照組的飲酒率無統(tǒng)計學(xué)差異（25.1%、24.3%、24.6%和24.1%）。CHB

11、、LC和 HCC三組的 TBIL、DBIL、IBIL、TP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST和 ALT/AST有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.001）。
　　3 PNPLA3各多態(tài)性位點不同基因型的分布特征
　　PNPLA3 rs738408 TC基因型的年齡低于 CC/TT基因型（P=0.049）；PNPLA3基因的5個多態(tài)性位點的不同基因型在不同變量上均未見統(tǒng)計學(xué)差異，包括年齡、性別、吸煙情況、飲酒情況以及各項實驗室檢查指標(biāo)

12、（TBIL、IBIL、TP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST和AST/AST）（P>0.05）。
　　4 PNPLA3各多態(tài)性位點基因型頻率在不同人群中的分布情況
　　在總?cè)巳褐?，PNPLA3 rs738408和rs2294918兩個位點的基因型在健康對照、自然清除者、CHB、LC和 HCC患者中分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。在女性人群中，rs738408和rs2294918兩個位點的基因型在健康對照、自然清

13、除者、CHB、LC和 HCC患者中分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ rs738408：P=0.012， rs2294918：P=0.001）。在男性人群中， rs2294918位點的基因型在健康對照、自然清除者、CHB、LC和HCC患者中分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.026）。
　　結(jié)論：
　　1對健康對照、HBV自然清除、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化和肝細胞癌5個亞組的研究對象進行人口學(xué)和實驗室指標(biāo)進行分析，結(jié)果顯示年齡、性別、吸煙和飲

14、酒可能與慢性 HBV感染及 HBV相關(guān)肝細胞癌的發(fā)生有關(guān)。
　　2在總?cè)巳汉团匀巳褐?，rs738408和rs2294918的基因型在健康對照、自然清除者、CHB、LC和 HCC患者中分布有統(tǒng)計學(xué)差異；在男性居民中rs2294918的基因型在健康對照、自然清除者、CHB、LC和HCC患者中分布有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第二部分：PNPLA3基因多態(tài)性與HBV感染易感性的關(guān)聯(lián)性分析
　　目的：
　　探討 PNPLA3基因

15、多態(tài)性（ rs738408、rs738409、rs2294918、rs2294919和rs2281135）與HBV慢性感染的相關(guān)性，分析PNPLA3遺傳多態(tài)性與環(huán)境因素（如吸煙、飲酒）在慢性HBV感染中的交互作用。
　　方法：
　　采用病例對照研究方法，符合納入條件的研究對象共2410例，分為2個亞組，其中病例組共1792例，包括慢性乙型肝炎患者691例，乙肝肝硬化患者680例和肝癌患者421例；對照組共618例，包括248

16、例HBV自然清除者和370例健康人。采用調(diào)查問卷收集研究對象的一般資料，采集外周靜脈血5ml，提取其DNA，運用美國 SEQUENOM公司MassARRAY時間飛行質(zhì)譜技術(shù)進行基因分型檢測。采用一般?2檢驗、Armitage趨勢檢驗、多重Logistic回歸分析和單倍型分析等統(tǒng)計分析方法，對PNPLA3基因多個SNP位點及HBV感染易感性的關(guān)聯(lián)性進行分析并計算比值比（ odds ratio， OR）和其95%可信區(qū)間（95% confi

17、dence intervals，95%CI）。由IBM SPSS22.0統(tǒng)計軟件和Haploview4.2軟件完成數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1 PNPLA3各多態(tài)性位點基因型頻率的分布與HBV感染的關(guān)系
　　以未感染 HBV人群作為對照，與 CC基因型相比，攜帶 PNPLA3 rs738408位點TC、TT或T等位基因顯著降低HBV感染的風(fēng)險（TC vs. CC：OR=0.558,95% CI=0.405-0.770

18、；TT vs. CC：OR=0.659，95%CI=0.472-0.919；T vs. C：OR=0.638，95% CI=0.502-0.811）。與 GG基因型相比，攜帶PNPLA3 rs2294918位點AG基因型顯著增加了HBV感染的風(fēng)險（OR=1.363,95% CI=1.092-1.702），但攜帶此位點AA基因型卻顯著降低了HBV感染的風(fēng)險（OR=0.511,95% CI=0.354-0.736）。未發(fā)現(xiàn)PNPLA3其他位

19、點的基因型與HBV感染有關(guān)聯(lián)。
　　按性別進行分層后，以女性未感染HBV人群作為對照，與 CC基因型相比，攜帶PNPLA3 rs738408位點TC基因型或T等位基因顯著降低HBV感染的風(fēng)險（ TC vs. CC：OR=0.428,95% CI=0.290-0.788；T vs. C：OR=0.594，95% CI=0.407-0.868）。與 GG基因型相比，攜帶PNPLA3 rs2294918位點 AA基因型顯著降低了 HBV

20、感染的風(fēng)險（OR=0.467,95%CI=0.256-0.851）。未發(fā)現(xiàn)PNPLA3其他位點的基因型與HBV感染有關(guān)聯(lián)。
　　以男性未感染 HBV人群作為對照，與 C等位基因相比，攜帶PNPLA3 rs738408位點 T等位基因顯著降低 HBV感染的風(fēng)險（OR=0.687，95%CI=0.501-0.944）。與GG基因型相比，攜帶PNPLA3 rs2294918位點 AG基因型顯著增加了 HBV感染的風(fēng)險（ OR=1.383

21、,95% CI=1.037-1.843），但攜帶此位點 AA基因型卻顯著降低了 HBV感染的風(fēng)險（OR=0.541,95%CI=0.338-0.866）。未發(fā)現(xiàn)PNPLA3其他位點的基因型與HBV感染有關(guān)聯(lián)。
　　2 PNPLA3基因各SNP位點與HBV感染易感性的關(guān)聯(lián)性分析
　　在控制了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，PNPLA3的 rs738408、rs738409、rs2294918和rs2294919位點均與HBV的易

22、感性仍存在關(guān)聯(lián)。攜帶rs738408 TC或TT基因型的個體感染HBV的風(fēng)險降低，OR值分別為0.059和0.020（95%CI=0.028-0.125，P<0.001；95%CI=0.007-0.053， P<0.001）；攜帶 rs738409 GG基因型的個體感染 HBV的可能性為rs738409 CC基因型攜帶者的27.550倍（95% CI=10.024-75.718, P<0.001）；攜帶 rs2294918 AA基因型的

23、個體感染 HBV的風(fēng)險降低， OR值為0.354（95% CI=0.210-0.599，P<0.001）；攜帶rs2294919 TC基因型的個體感染 HBV的風(fēng)險降低， OR值為0.598（95% CI=0.429-0.833， P=0.002）。男性感染 HBV的風(fēng)險是女性的1.975倍（95%CI=1.572-2.480，P<0.001），尚未發(fā)現(xiàn)年齡、吸煙、飲酒與 HBV感染的相關(guān)性。
　　3基因與環(huán)境因素的交互作用分析<

24、br>　　校正了性別、年齡因素后，PNPLA3基因的5個 SNP位點與吸煙或飲酒均未發(fā)現(xiàn)存在交互作用。
　　4單倍型分析
　　PNPLA3 rs2281135和rs2294919組成單體域（Haplotype block）1，但其單倍型AC、GT和GC在慢性HBV感染者和非慢性HBV感染者中無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1不論是在總?cè)巳海€是男性或女性人群中，PNPLA3 rs738408位點T

25、C、TT或T等位基因和rs2294918位點AA基因型均能降低HBV感染風(fēng)險，而rs2294918位點AG基因型反而增加HBV感染的風(fēng)險。
　　2在控制了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，PNPLA3基因各SNP位點與HBV感染易感性的關(guān)聯(lián)性分析顯示rs738408 TC或TT基因型、rs738409 GG基因型、rs2294918 AA基因型和rs2294919 TC基因型均與HBV感染有關(guān)，性別也是HBV感染的重要影響因素。

26、>　　3校正了性別、年齡因素后，未發(fā)現(xiàn)PNPLA3基因的5個位點與吸煙、飲酒之間存在交互作用。
　　4 PNPLA3的兩個位點 rs2281135和 rs2294919組成單體域，但其單倍型AC、GT和GC在慢性HBV感染者和非慢性HBV感染者中無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第三部分：PNPLA3基因多態(tài)性與乙肝相關(guān)肝細胞癌的關(guān)聯(lián)性分析
　　目的：
　　探討 PNPLA3基因多態(tài)性（ rs738408、rs738409、r

27、s2294918、rs2294919和 rs2281135）與 HBV-HCC的相關(guān)性，分析 PNPLA3遺傳多態(tài)性與環(huán)境因素（如吸煙、飲酒）在HCC發(fā)生中的交互作用。
　　方法：
　　采用病例對照研究方法，符合納入條件的研究對象共2410例，病例組為421例HBV相關(guān)性肝癌（ HCC）患者，分別以370例健康體檢者、248例HBV自然清除（NC）者、691例慢性乙型肝炎（CHB）患者和680例肝硬化（LC）患者為作為對照組

28、。采用調(diào)查問卷收集研究對象的一般資料，采集外周靜脈血5ml，提取其DNA，運用美國 SEQUENOM公司MassARRAY時間飛行質(zhì)譜技術(shù)進行基因分型檢測。采用一般?2檢驗、Armitage趨勢檢驗、多重Logistic回歸分析和單倍型分析等統(tǒng)計分析方法，對PNPLA3基因多個SNP位點及HBV相關(guān)性肝癌的關(guān)聯(lián)性進行分析并計算比值比（ odds ratio， OR）和其95%可信區(qū)間（95% confidence intervals，9

29、5%CI）。由IBM SPSS22.0統(tǒng)計軟件和Haploview4.2軟件完成數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1 PNPLA3各多態(tài)性位點基因型頻率的分布與乙肝相關(guān)肝細胞癌的關(guān)系
　　以健康人群作為對照，與 CC基因型相比，攜帶 PNPLA3 rs738408位點 TC或 T等位基因顯著降低 HBV-HCC的風(fēng)險（OR=0.412,95%CI=0.252-0.674；OR=0.538，95% CI=0.371-0.779

30、）。與 GG基因型相比，攜帶 PNPLA3 rs2294918位點 AG基因型顯著增加了 HBV-HCC的風(fēng)險（ OR=1.621,95% CI=1.171-2.244）。與 CC基因型相比，攜帶PNPLA3 rs2294919位點 TC基因型顯著降低了 HBV-HCC的風(fēng)險（OR=0.710,95%CI=0.536-0.960）。未發(fā)現(xiàn)PNPLA3其他位點的基因型與HBV-HCC有關(guān)聯(lián)。
　　以自然清除人群作為對照，與 GG基因

31、型相比，攜帶 PNPLA3 rs2294918位點 AG基因型顯著增加了 HBV-HCC的風(fēng)險（ OR=1.534,95% CI=1.052-2.237），但 AA基因型卻降低了 HBV-HCC的風(fēng)險（OR=0.438,95%CI=0.236-0.812）。未發(fā)現(xiàn)PNPLA3其他位點的基因型與HBV-HCC有關(guān)聯(lián)。
　　以非肝癌 HBV感染者（CHB、LC）作為對照，未發(fā)現(xiàn) PNPLA3多態(tài)性與HCC的顯著相關(guān)性。
　　2

32、PNPLA3基因各SNP位點與乙肝相關(guān)肝細胞癌的關(guān)聯(lián)性分析
　　以 HBV-HCC為病例組，以健康者為對照組，在控制了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，PNPLA3的 rs2294918和 rs2294919位點均與HBV-HCC的發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。攜帶 rs2294918 AG基因型的個體患HBV-HCC的風(fēng)險是 GG基因型的1.872倍（95% CI=1.256-2.791， P=0.002）；攜帶rs2294919 TC基因型的

33、個體患HBV-HCC的風(fēng)險降低， OR值為0.605（95% CI=0.413-0.886，P=0.010）。男性患 HBV-HCC的風(fēng)險是女性的2.372倍（95% CI=1.613-3.490，P<0.001）；年齡增高，患HBV-HCC的風(fēng)險大大升高，≥45歲人群患HBV-HCC的風(fēng)險是<45歲人群的8.366倍（95% CI=5.393-12.975，P<0.001）；尚未發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒與HBV-HCC患病的相關(guān)性。
　　

34、以HBV-HCC為病例組，以HBV自然清除者為對照組，在控制了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，PNPLA3的rs2294918與HBV-HCC的發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。攜帶rs2294918 AG基因型的個體患HBV-HCC的風(fēng)險是 GG基因型的1.529倍（95% CI=1.004-2.329， P=0.048）。男性患HBV-HCC的風(fēng)險是女性的1.891倍（95% CI=1.245-2.871，P=0.003）；年齡增高，患 HBV-HC

35、C的風(fēng)險大大升高，≥45歲人群患 HBV-HCC的風(fēng)險是<45歲人群的6.159倍（95% CI=3.815-9.943，P<0.001）；尚未發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒與HBV-HCC患病的相關(guān)性。
　　以HBV-HCC為病例組，以CHB為對照組，在控制了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，PNPLA3的5個位點均與 HBV-HCC的發(fā)生風(fēng)險無關(guān)聯(lián)。男性患 HBV-HCC的風(fēng)險是女性的1.867倍（95% CI=1.284-2.717，P=0.0

36、01）；年齡增高，患 HBV-HCC的風(fēng)險大大升高，≥45歲人群患 HBV-HCC的風(fēng)險是<45歲人群的20.952倍（95% CI=13.944-31.483，P<0.001）；尚未發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒與HBV-HCC患病的相關(guān)性。
　　以 HBV-HCC為病例組，以 LC為對照組，在控制了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，PNPLA3的5個位點均與 HBV-HCC的發(fā)生風(fēng)險無關(guān)聯(lián)。年齡增高，患 HBV-HCC的風(fēng)險大大升高，≥45歲人群

37、患 HBV-HCC的風(fēng)險是<45歲人群的3.276倍（95% CI=2.150-4.990， P<0.001）；吸煙者患 HBV-HCC的風(fēng)險是不吸煙者的1.541倍（95%CI=1.081-2.196，P=0.017）；尚未發(fā)現(xiàn)性別、飲酒與 HBV-HCC患病的相關(guān)性。
　　3基因與環(huán)境因素的交互作用分析
　　校正了性別、年齡因素后，以 CHB作為對照組，僅發(fā)現(xiàn) PNPLA3 rs738409位點 GC基因型與吸煙在 HC

38、C發(fā)病中存在交互作用，OR值為0.556（95% CI=0.309-0.998， P=0.049）。此外， PNPLA3基因的5個SNP位點與吸煙或飲酒均未發(fā)現(xiàn)存在交互作用。
　　4單倍型分析
　　以健康人群作為對照組， HCC作為病例組進行分析， rs738409和rs2281135組成Block1，rs2294918和rs2294919組成Block2；rs738409和 rs2281135組成的單體域中，其中單倍型 C

39、A在 HCC患者和健康者中有統(tǒng)計學(xué)差異（0.01935.478,2?? P?）。未發(fā)現(xiàn)其他單體域的單倍型在組間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1 PNPLA3 rs738408位點 TC或 T等位基因和rs2294919位點 TC基因型是健康人群患HBV-HCC的保護因素，而rs2294918位點AG基因型是危險因素。PNPLA3 rs2294918位點 AA基因型是 HBV自然清除者患HBV-HCC的保護因素，而 AG基因

40、型是其危險因素。PNPLA3 rs2294918位點 AG基因型是女性慢性乙型肝炎患 HBV-HCC的危險因素。
　　2在控制了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，以健康人群為對照， PNPLA3的rs2294918和rs2294919位點均與HBV-HCC的發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)；以 HBV自然清除者為對照組，PNPLA3的 rs2294918與 HBV-HCC的發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)；以CHB或LC為對照組，PNPLA3的5個位點均與HBV-H