UC-iPSC向NSC分化體系的比較及NSC在HIE模型中的初步研究.pdf

1、目的：
　　比較抑制劑濃度及誘導初始密度的不同對尿液細胞重編程所得誘導性多能干細胞（urine cells derived induced pluripotentstem cells，UC-iPSC）向神經干細胞分化效率及神經干細胞（neural stem cells,NSC）生存狀態(tài)的影響，從而確定一種較穩(wěn)定、高效的誘導分化的方法；檢測 UC-iPSC源性神經干細胞在新生大鼠缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic en

2、cephalopathy,HIE)動物模型腦內的生存、遷移及分化能力。
　　方法：
　　比較不同誘導體系誘導 UC-iPSC向神經干細胞分化的效率及神經干細胞生存狀態(tài)的影響：A體系：SB431542和Drosomophorin的濃度均為5 um/ml,誘導初始密度為100％， B體系：SB431542的濃度為5um/ml, Drosomophorin的濃度為1um/ml,誘導初始密度為30-50%。通過觀察誘導獲得的神經干細

3、胞的形態(tài)學變化；q-PCR比較神經干細胞相關基因Pax6，Nestin,Sox1,Sox2的表達量及流式細胞術比較誘導第16天Pax6的陽性率等方法比較兩種體系的誘導效率。建立HI E模型：取出生7天的SD大鼠，行左側頸總動脈結扎、離斷手術，繼而在8% O2，92% N238℃條件下缺氧120mins，建立HIE的疾病動物模型。造模后第7天，TTC染色觀察大腦損傷灶。神經干細胞移植：動物模型建立后第3天，取已鑒定的UC-iPSC源性神經

4、干細胞3μL、1×105移植入疾病模型鼠側腦室內。分別于第7、28天，心臟灌流取腦、固定、切片、免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察分析外源性神經干細胞在模型動物腦內的生存、遷移及分化的情況。
　　結果：
　　A體系獲得的第1代神經干細胞，呈明亮的圓球形，聚集緊密；B體系獲得的第1代神經干細胞，則呈灰暗的不規(guī)則形，聚集松散。q-PCR顯示A體系誘導獲得的細胞神經干相關基因的表達量高于 B體系。流式細胞術分析誘導第3代神經干細胞

5、高表達Pax6,Nestin,Sox1,Sox2等神經干細胞相關基因。自發(fā)分化第20天，形成明顯的神經纖維束，免疫熒光證明該細胞高表達TUJ-1，MAP2等神經元的特異性標志物及部分細胞表達星形膠質細胞的特異性標志物GFAP。TTC染色顯示建模后第7天在腦皮質、紋狀體及海馬部位存在明顯的白色損傷區(qū)域。UC-iPSC源性神經干細胞移植后第7天，免疫熒光染色可在左側腦室內及室管壁檢測到Nestin與Stem121雙陽性細胞，即移植的神經干細