誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向卵母細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、第一部分小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及多能性鑒定
　　目的:探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外分離培養(yǎng)方法,鑒定BMSCs的分化潛能。
　　方法:采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離4～6周齡小鼠BMSCs,通過傳代培養(yǎng)進(jìn)一步純化擴(kuò)增,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特征。P3 BMSCs經(jīng)成脂和成骨誘導(dǎo),2周后行油紅O和堿性磷酸酶染色,3周后行茜素紅染色,進(jìn)行脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞鑒定。
　　結(jié)果:①細(xì)胞培養(yǎng)情況24 h內(nèi)

2、即可見少量細(xì)胞貼壁伸展,48 h后細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng),原代細(xì)胞呈梭形、圓形、多角形等,7～8 d80％的細(xì)胞融合。傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,傳代周期5~6d。②多能性鑒定 P3 BMSCs經(jīng)成脂和成骨定向誘導(dǎo),油紅0、堿性磷酸酶和茜素紅染色鑒定,證實(shí)BMSCs可分化為脂肪細(xì)胞和成骨。
　　結(jié)論:全骨髓貼壁法是一種較為理想的體外分離擴(kuò)增BMSCs的培養(yǎng)體系。BMSCs具備向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞多向分化潛能,可作為骨組織工程的種子細(xì)胞。

3、　　第二部分不同濃度BMP4對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化效應(yīng)
　　目的:探討(bone morphogenetic protein4,BMP4)BMP4誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向生殖細(xì)胞分化的最佳濃度。
　　方法:全骨髓培養(yǎng)法獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組向P3 BMSCs中添加不同濃度(5,10,20,40,80ng/ml)的BMP4,以不添加BMP4的空白組作為對(duì)照,4天后,MTT法和臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的增殖率和存活率

4、,RT-qPCR檢測(cè)生殖細(xì)胞早期階段特異性調(diào)控基因(Oct4、Dazl、Fragilis、Mvh、Nobox和Stella)的表達(dá)。
　　結(jié)果:在BMP4濃度為5,10,20ng/ml時(shí)BMSCs存活率最高,三組間存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差,均顯著高于0,40,80ng/ml組(P<0.05),且BMP4濃度為5ng/ml及20ng/ml時(shí),BMSC增殖率最高。Mvh、Fragilis、OCT-4、Dazl及Stella的mRNA表達(dá)水平均

5、在20 ng/ml組達(dá)到最高,顯著高于與其它組及對(duì)照組比(P<0.05);Nobox mRNA水平則在40ng/ml組最高,不同BMP4濃度組以及與對(duì)照組間兩兩比較均有顯著性差異(P<0.05);各組Stra8和Gdf9 mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:BMP4誘導(dǎo)濃度在20ng/ml時(shí),骨髓干細(xì)胞的存活率、增殖率及生殖細(xì)胞特異性基因表達(dá)最高,為最佳誘導(dǎo)濃度。
　　第三部分誘導(dǎo)

6、骨髓SSEA-1+干細(xì)胞向卵母細(xì)胞分化的初步研究
　　目的:探討骨髓SSEA-1+干細(xì)胞向卵母細(xì)胞分化的潛能。
　　方法:采用免疫磁珠分選系統(tǒng)(magnetic-activated cell sorting,MACS)分選骨髓中SSEA-1干細(xì)胞,接種于絲裂霉素C處理的小鼠成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,mEFs)飼養(yǎng)層上,在含1000U/ml白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)液中將SSEA-

7、1+干細(xì)胞傳代培養(yǎng)至P2,撤去飼養(yǎng)層,在濃度為20ng/mlBMP4的培養(yǎng)液中進(jìn)行定向誘導(dǎo),并分階段加入10%人卵泡液、0.005IU/mlFSH和0.003 IU/ml LH。鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,RT-qPCR檢測(cè)不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)生殖細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:骨髓SSEA-1+干細(xì)胞生殖細(xì)胞特異性基因表達(dá)水平較小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞和SSEA-1-組顯著升高(P<0.05)。小鼠

8、骨髓SSEA-1+干細(xì)胞與mEFs共培養(yǎng)后呈圓形,堿性磷酸酶染色陽性,細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。SSEA-1+干細(xì)胞誘導(dǎo)7天形成細(xì)胞集落,細(xì)胞密度變小。繼續(xù)培養(yǎng)4天可見類胚體(EB)樣結(jié)構(gòu)形成,細(xì)胞體積變大,誘導(dǎo)至21天可觀察到卵母細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)。隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)生殖細(xì)胞特異性基因尤其卵母細(xì)胞減數(shù)分裂基因Stra8和Gdf9表達(dá)水平明顯升高。誘導(dǎo)14天檢測(cè)到生殖細(xì)胞特異性蛋白Mvh表達(dá)。
　　結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外經(jīng)BMP4及細(xì)胞因子誘