人臍帶血來(lái)源的干細(xì)胞在HIE鼠腦內(nèi)的定殖及分化.pdf

1、[背景與目的]:在我國(guó),每年出生的新生兒中,有7％-10%(140-200萬(wàn))的新生兒發(fā)生窒息,30萬(wàn)左右的窒息兒出現(xiàn)不同程度的殘疾,是引起新生兒死亡、小兒腦癱的主要原因。降低 HIE的死亡率、腦癱等后遺癥等發(fā)生率,可產(chǎn)生極大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。HIE的治療目前立足于用多種腦細(xì)胞活性藥物,并通過(guò)康復(fù)鍛煉促進(jìn)其功能改善,但對(duì)已經(jīng)死亡的腦細(xì)胞則無(wú)能為力。因此,用NSC促進(jìn)神經(jīng)元再生以達(dá)到修復(fù)作用成了一條新的治療渠道。本研究基于前人研究的基礎(chǔ),

2、以臍帶血為研究對(duì)象,研究人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的生物學(xué)活性;建立可靠的缺氧缺血?jiǎng)游锬Ｐ?探討臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植在HIE鼠腦內(nèi)后的定殖及向神經(jīng)樣細(xì)胞的分化情況。
　　[方法]:用FACScan檢測(cè)MSCs表面相關(guān)抗原 CD29、CD44、CD59、 CD33,用丹參誘導(dǎo)人臍血原代細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化,并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定;結(jié)扎七日新生鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈,缺氧3小時(shí),觀測(cè)缺氧過(guò)程中鼠的臨床表現(xiàn),缺氧后3天后作

3、鼠腦組織切片,觀察病理改變;用 Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞,37℃孵育24h,并在模型制作成功當(dāng)天,立體定位注射或是通過(guò)尾靜脈將細(xì)胞注射到實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi),14天后,將鼠腦制成10μm厚的冰凍切片,觀察細(xì)胞的存活及分布情況,最后用雙染法來(lái)檢測(cè)干細(xì)胞的分化。
　　[結(jié)果]:人臍血原代細(xì)胞中,MSCs的表面標(biāo)記CD29、CD44、CD59的陽(yáng)性率分別是10.7%、37.27%和66.67%;原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞形態(tài)呈大小不等的圓形和條形

4、,用丹參誘導(dǎo),可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記,如神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記nestin,神經(jīng)元的標(biāo)記β-Ⅲ類神經(jīng)微管(β-TubulinⅢ)、神經(jīng)微絲(NF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP);缺氧20min后,動(dòng)物煩躁不安,時(shí)間更長(zhǎng)后,會(huì)依次表現(xiàn)出發(fā)紺、嗜睡、激惹、角弓反張等現(xiàn)象;HE染色,可觀察到神經(jīng)元細(xì)胞壞死、細(xì)胞核發(fā)生碎裂,溶解,這證明HIE模型建立成功;細(xì)胞孵育24h后,可看到干細(xì)胞發(fā)藍(lán)光,觀察冰凍切片時(shí)候可見(jiàn)到經(jīng)立體注射的細(xì)胞主要成

5、團(tuán)分布在注射部位周圍,而經(jīng)外周注射的細(xì)胞主要均勻散布在腦內(nèi),經(jīng)兩種方式注射的細(xì)胞均能和宿主腦組織融合在一起,而對(duì)照組則顯示出陰性的結(jié)果;用雙染法可檢測(cè)到少量的MSCs表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(Nestin),未檢測(cè)到神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。
　　[結(jié)論]:人臍血是 MSCs的來(lái)源之一,丹參可誘導(dǎo)人臍血干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,丹參可作為神經(jīng)誘導(dǎo)劑,人臍血干細(xì)胞可作為神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源;采用小鼠