新的甾體類藥物NSC67657誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化時(shí)關(guān)鍵蛋白的篩選、鑒定及其功能研究.pdf

1、重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文新的甾體類藥物NSC67657誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化時(shí)關(guān)鍵蛋白的篩選、鑒定及其功能研究姓名：王偉佳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：邱宗蔭20090501重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文提取法、三氯乙酸／丙酮沉淀法、超聲破碎法等蛋白提取方法，在傳統(tǒng)電泳和改良電泳條件下進(jìn)行細(xì)胞全蛋白分離，并做蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)數(shù)和凝膠重復(fù)性分析，尋找新的針對(duì)HL60細(xì)胞省時(shí)高效的雙向電泳條件。3運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組在最適電泳分離條件

2、下，分析HL60細(xì)胞在分化前，和向單核、粒系分化后的差異表達(dá)蛋白譜：依照前面優(yōu)化雙向電泳分離條件，對(duì)分化前和向單核系、粒系分化后HL60細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分離，用PDquest(70)軟件對(duì)掃描的二維凝膠電泳圖像進(jìn)行分析，篩選出HL60細(xì)胞分化前后差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)。候選差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解，MALDITOFMS分析，得到肽指紋圖譜(peptidemossfingerprinting，PMF)，使用Mascot軟件在Swisspro

3、t數(shù)據(jù)庫中檢索鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。4驗(yàn)證僅出現(xiàn)在NSC67657處理組的差異蛋白點(diǎn)ICAT的表達(dá)差異情況，并對(duì)ICAT蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位：使用NSC67657和ATRA分別作用HL60細(xì)胞，誘導(dǎo)其向兩系分化，分別用RTPCR、Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞分化前后ICAT在mRNA與蛋白水平的變化情況；然后雙染ICAT蛋白和HL60細(xì)胞核，采用激光共聚焦的方法觀察ICAT蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，并對(duì)