Tiam1及Nm23-h1在惡性黑色素瘤中的表達(dá).pdf

1、背景及目的：
　　惡性黑色素瘤簡(jiǎn)稱惡黑（Malignant Melanoma，MM），是一種高度惡性腫瘤。其主要起源于黑色素細(xì)胞，多見(jiàn)于皮膚及粘膜。皮膚惡性黑色素瘤（Cutaneous Malignant Melanoma，CMM)與其他體表腫瘤相比，侵襲及轉(zhuǎn)移最具特征性，也是影響患者預(yù)后最重要的原因。CMM侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制異常復(fù)雜，是由多種致病因素、多個(gè)發(fā)病步驟及階段共同作用的結(jié)果。Liotta提出的惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的三步假說(shuō)即粘附

2、、降解、移動(dòng)。包括原發(fā)灶處腫瘤細(xì)胞的脫落，通過(guò)各種作用機(jī)制進(jìn)入血運(yùn)及淋巴管中播散，隨后在其他器官組織處粘附，之后通過(guò)分泌相關(guān)因子加速新生血管生成并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的對(duì)抗作用，最終形成新的惡性腫瘤病灶。目前各項(xiàng)有關(guān)研究表明其中尤為重要的因素是其相關(guān)癌基因的激活及其抑癌基因表達(dá)降低或消失，引起癌細(xì)胞增殖及侵襲能力增強(qiáng)而致病。因此針對(duì)惡黑的各種癌基因及抑癌基因作為靶點(diǎn)的基因治療逐漸成為一個(gè)有效治療方法。
　　T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘

3、導(dǎo)因子1（T lymphoma invasion and metastasis inducing factor1,Tiam1）編碼的Tiam1蛋白是一系列Roh樣GTPase的鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)換因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）。Tiam1主要能參與GDP與GTP的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，從而進(jìn)一步影響微管蛋白的聚合和解聚；另外進(jìn)一步激活Rac1(Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1),參與JNK激酶（c-jun

4、N-terminal kinase）、p38 MAPK激酶（mitogen activated protein kinase）等下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)上述作用機(jī)制對(duì)機(jī)體的細(xì)胞骨架進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞的形變及偽足的形成，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移能力。同時(shí)對(duì)微管蛋白進(jìn)行調(diào)控并與其他基因協(xié)同作用共同影響細(xì)胞的增殖與凋亡。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用。
　　轉(zhuǎn)移抑制因子23(non-metastasis23 homologu

5、e1,Nm23-h1)基因是近來(lái)研究較多的一個(gè)基因。Nm23-h1的生物活性主要通過(guò)其編碼蛋白產(chǎn)物核苷二磷酸激酶(NDPK)來(lái)實(shí)現(xiàn)。NDPK一方面直接參與微管蛋白的聚合與解聚從而調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；另一方面NDPK通過(guò)多種方式參與G蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖與形態(tài)變化；另外其與 Rho家族成員廣泛藕聯(lián)，通過(guò)對(duì)下游基因的表達(dá)調(diào)控來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR法了解Tiam1及Nm23-h1在

6、A375細(xì)胞和正常皮膚組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平差異，利用免疫組化方法檢測(cè)Tiam1及Nm23-h1蛋白在皮膚惡性黑色素瘤、皮膚交界痣和正常皮膚組織中的表達(dá)。初步探究其與惡性黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性，并進(jìn)一步了解Tiam1與Nm23-h1之間的相關(guān)作用。此次研究在于揭示Tiam1及Nm23-h1在惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律，為臨床基因靶向治療惡黑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　采用RT-PCR法檢測(cè)Tiam1

7、及Nm23-h1mRNA在A375細(xì)胞及正常皮膚組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平差異。運(yùn)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用 t檢驗(yàn)法，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的α=0.05，P<0.05。
　　收集2010～2014年期間鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的皮膚惡性黑色素瘤蠟塊66例，交界痣30例。年齡22～76歲不等，平均年齡58.8±9.2歲；男性36例，女性30例；對(duì)照組所采用的正常皮膚組織20例來(lái)自于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)

8、切除的多余正常全厚皮膚組織。以上所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象具有完整的病史資料，無(wú)相關(guān)疾病病史，也未行相關(guān)如冷凍、化學(xué)藥物、激光及放射等治療。各組患者性別、年齡及病變部位等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。66例CMM、30例皮膚交界痣和20例正常皮膚組織中Tiam1及Nm23-h1蛋白的表達(dá)水平采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)和 pearson法相關(guān)性分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的α=0.05， P<0.0

9、5。
　　結(jié)果：
　　1.人正常皮膚組織及人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中Tiam1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.001±0.074、2.546±0.357，正常皮膚組織及 A375細(xì)胞中 Nm23-h1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.999±0.034、0.953±0.022。Tiam1 mRNA在人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于其在人正常皮膚組織中的表達(dá)；Nm23-h1 mRNA在人惡性黑色素瘤 A375細(xì)胞中的表達(dá)

10、低于其在人正常皮膚組織中的表達(dá)，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.Tiam1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒。Tiam蛋白在CMM、皮膚交界痣及正常皮膚組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.79％(52/66)、46.67%(14/30)和10.00%(2/20)，呈逐漸降低趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)學(xué)意義(P<0.05)。三組間兩兩比較顯示：CMM組中Tiam1蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯高于其在皮膚交界痣中的陽(yáng)性表達(dá)，其在交界痣的表達(dá)明顯高于

11、正常皮膚組織中的表達(dá)(P<0.05)；在CMM中隨腫瘤浸潤(rùn)深度的增加Tiam1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)也逐漸增高，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CMM患者中 Tiam1蛋白表達(dá)水平高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05)。
　　3.Nm23-h1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀。Nm23-h1蛋白在CMM、皮膚交界痣及正常皮膚組中陽(yáng)性表達(dá)率為15.15%（10/66）、44.67%（14/30）和80.00%（16/20）。

12、Nm23-h1蛋白在CMM、皮膚交界痣及正常皮膚中表達(dá)逐漸增強(qiáng)，其在三組中的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三組間兩兩比較顯示： CMM組中Nm23-h1蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯低于其在皮膚交界痣中的陽(yáng)性表達(dá)，其在交界痣的表達(dá)明顯低于正常皮膚組織中的表達(dá)(P<0.05)；在 CMM中隨腫瘤浸潤(rùn)深度的增加Nm23-h1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)也逐漸降低，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CMM患者中Nm23-h1蛋白表達(dá)水平低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，并且差異均

13、具有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05)。
　　4.Tiam1及Nm23-h1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析：Tiam1蛋白的表達(dá)與Nm23-h1蛋白的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.298, P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Tiam1在惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在促進(jìn)作用。
　　2.Nm23-h1在惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起一定的抑制作用。
　　3.Tiam1、Nm23-h1可能作為治療惡性黑色素瘤的基因靶點(diǎn)，為惡