貴州山銀花質(zhì)量標準提升及鉤藤質(zhì)量分析研究.pdf

1、目的:為保證臨床用中藥鉤藤、山銀花的質(zhì)量，本文對主產(chǎn)于貴州人工種植及野生的鉤藤、山銀花藥材進行內(nèi)在質(zhì)量分析研究。①建立能反應鉤藤質(zhì)量的藥效成分的含量分析方法，提升山銀花藥材的質(zhì)量標準。②其次掌握鉤藤、山銀花內(nèi)在質(zhì)量變化規(guī)律，為中藥及中成藥研制生產(chǎn)提供高質(zhì)量的原料藥材。
　　方法:①本課題通過采用Agilent1260高效液相色譜儀;[色譜柱:Discovery HSC18柱(25cm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈(A)～0.

2、4％醋酸(B)（梯度洗脫:0～10min,88.5％～55％B;10～12min,85％～71％B;12min～18min,71％～77％B;18～30min，67％～55％B;）;DAD檢測器，檢測波長:327nm;柱溫:30℃;流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL]及Agilent1601A高效毛細管電泳儀，以腺苷為內(nèi)標，[毛細管:75μm×32cm的熔融石英毛細管柱，有效長度為23.7cm;DAD檢測器，檢測波長為245

3、nm;以10mmol·L-1硼砂溶液作為緩沖液;工作電壓為20kV;柱溫20℃;壓力進樣:20mbar×20s，電解質(zhì)封口:20mbar×20s;每次進樣前分別用蒸餾水沖柱5min，緩沖液沖柱10min]對綠原酸含量進行含量測定，并將結(jié)果進行對比分析;②采用waters超高液相色譜儀，[色譜柱:ACQUITYUPLC@BEH C181.7μm;流動相:乙腈(A)～0.4％醋酸(B)（梯度洗脫:0～3.5min,88.5％～85％B;3.

4、5～5min,85％～71％B;5min～9min,71％～67％B;9～15min，67％～55％ B;)ELSD檢測器;柱溫:30℃;增益:100;數(shù)據(jù)率:20;漂移管溫度:60℃;氣體壓力:20Pi;噴霧冷卻;流速:0.5mL·min-1;進樣量:5μL]測定了川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷乙;③采用Agilent1260高效液相色譜儀;[色譜柱:WondaSil C18柱(4.6×200mm,5μm);流動相:乙腈(A)～0.2％

5、氨水(B)(梯度洗脫:0～45min，72％～45％B;45min～60min，45％～37％B); DAD檢測器，檢測波長:254nm;柱溫:25℃;流速:1.0mL·min-1;進樣量:20μL]測定了去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、鉤藤堿的含量，并在此色譜條件下建立了毛鉤藤的指紋圖譜，且分別測定了華鉤藤、鉤藤的指紋圖譜;④采用島津UV-2501PC紫外-可見分光光度計，以蘆丁為對照，測定了山銀花中總黃銅的含量
　　結(jié)果:①PLC測

6、定山銀花中綠原酸含量的結(jié)果表明:綠原酸的回歸方程為:Y=851.31X+14.972，r=0.9992，線性范圍為:0.0328～0.5248μg;綠原酸平均含量為20.95μg·g-1，平均回收率為98.73％，RSD為2.53％; HPCE內(nèi)標法測定山銀花中綠原酸含量的結(jié)果表明:綠原酸的回歸方程為:Y=0.0729X+0.1627，r2=0.9991，當腺苷的濃度為0.10mg·mL-1時，綠原酸在1.03～17.51μg·mL-1

7、范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;綠原酸平均含量為21.72μg·g-1，平均回收率為100.24％，RSD為2.40％;②UPLC測定山銀花中川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷乙含量的結(jié)果表明:以峰面積的對數(shù)對進樣質(zhì)量的對數(shù)進行線性回歸，得到川續(xù)斷皂苷乙的回歸方程為:lnY=1.1992lnX+1.7185，r=0.9991，川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量濃度在102～1020ng的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;灰氈毛忍冬皂苷乙的回歸方程為:lnY=1.3878lnX+0.80

8、37，r=0.9999，灰氈毛忍冬皂苷乙質(zhì)量濃度在501～5010ng的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;川續(xù)斷皂苷乙平均百分含量為0.92％，平均回收率為98.57％，RSD為1.47％;灰氈毛忍冬皂苷乙平均含量為6.92％，平均回收率為99.64％，RSD為1.69％;③HPLC測定毛鉤藤中鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿含量的結(jié)果表明:鉤藤堿回歸方程為:Y=30.868X+7.8086，r=0.9990，線性范圍為:1～16μg;去氫鉤藤堿色譜

9、條件回歸方程為:Y=46.472X+3.7848，r=0.9995，線性范圍為:1～16μg;異去氫鉤藤堿色譜條件回歸方程為:Y=40.368X+10.775，r=0.9990，線性范圍為:1～16μg;鉤藤堿的平均含量為15.6556μg·g-1，RSD為2.53％，平均回收率為100.32％;去氫鉤藤堿的平均含量為30.9515μg·g-1，RSD為2.53％，平均回收率為99.07％;異去氫鉤藤堿的平均含量為20.2049μg·g

10、-1，RSD為2.41％，平均回收率為98.36％;HPLC建立了毛鉤藤的指紋圖譜，通過對12批毛鉤藤藥材指紋圖譜的測定，確定了10個峰為共有特征色譜峰，通過對指紋圖譜相似度的比較、分析，可以客觀、準確的對不同樣品之間的差異進行評價。將上述12批毛鉤藤藥材以及華鉤藤藥材、鉤藤藥材的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004A)，以毛鉤藤S1指紋圖譜為參照圖譜，中位數(shù)法和保留時間誤差范圍在0.2min以內(nèi)對指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理

11、分析，其平均相似度為0.856;④UV測定山銀花中總黃銅的含量結(jié)果表明:以對照品的濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)進行回歸計算，得總黃酮的回歸方程為:Y=0.0107X+0.0163，r=0.9994，總黃酮在8.016～80.160μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，總黃銅的平均百分含量為11.10％，平均回收率為98.70％，RSD為2.20％。
　　結(jié)論:1.通過對主要產(chǎn)自貴州的山銀花藥材進行綠原酸

12、、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷乙、總黃酮等成分的含量進行了準確測定研究，同時通過HPLC跟HPCE的對比分析，結(jié)果顯示兩者同時測定同一樣品時，之間的差別很小，充分說明了HPCE方法的可行性，由此建立了山銀花的HPCE分析方法，提升了山銀花的質(zhì)量標準，為山銀花在貴州地區(qū)的種植跟提供了理論依據(jù)。
　　2.采用HPLC對毛鉤藤藥材中鉤藤堿、去氫鉤藤堿，異去氫鉤藤堿進行含量測定，發(fā)現(xiàn)鉤藤堿、去氫鉤藤堿，異去氫鉤藤堿的含量普遍較低，且隨著采

13、收時期的不同，其含量也成規(guī)律性變化，每年的6～10月份三者含量均降低到最低，12月份到第二年3月份三者含量達到最高;與《中國藥典》2010版本規(guī)定的鉤藤采收期為春、秋兩季采挖存在差異，為貴州省的鉤藤的合理采收跟種植提供了理論依據(jù)。
　　3.采用HPLC建立了毛鉤藤藥材的指紋圖譜，其中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿都直觀的反應在了指紋圖譜上，采用聚類分析，毛鉤藤、華鉤藤、鉤藤三個不同的種之間對應的分成了三類，為種之間的鑒