Ad-pre-microRNA-193b重組腺病毒的構建及其抗白血病效應探討.pdf

1、目的:構建microRNA-193b（miR-193b）前體Ad-pre-miR-193b重組腺病毒載體，并鑒定其在慢性粒細胞白血病細胞株K562中的表達水平，進一步探討高效表達miR-193b對K562細胞的抑制效應及其作用機制，為后續(xù)研究miR-193b在CML動物模型中的抗白血病效應提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.化學合成miR-193b cDNA序列，克隆進入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒，經(jīng)Pme I酶切線性

2、化后轉入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中進行同源重組，獲得pAd-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒，再經(jīng)PacI線性化后轉入HEK293細胞中包裝、擴增。收集病毒后感染K562細胞（設為Ad-pre-miR-193b組），同時設空白組（K562細胞組）及空載病毒組（Ad組），采用QRT-PCR檢測K562細胞中miR-193b基因的表達水平。
　　2.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感

3、染K562細胞，同時設空白組（K562細胞組）及空載病毒組（Ad組），采用QRT-PCR檢測miR-193b基因的表達水平；QRT-PCR和Western Blot分別檢測bcr/abl融合基因、BCR/ABL融合蛋白的表達水平；CCK-8法檢測K562細胞的增殖情況，流式細胞術（FCM）檢測K562細胞凋亡率。
　　3.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感染K562細胞后，采用Western Blot檢測凋亡蛋白c

4、aspase-3的表達水平。
　　結果:
　　1.pAdTrack-CMV-pre-miR-193b重組穿梭質(zhì)粒和pAd-pre-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定及測序分析顯示構建成功；重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細胞中包裝成功，并能夠高效轉染 K562細胞；與對照組相比，QRT-PCR檢測顯示重組腺病毒載體感染K562細胞后其miR-193b基因表達水平明顯增加（P<0.01）。
　　2.與對照相比，

5、K562細胞在感染Ad-pre-miR-193b重組腺病毒后，其miR-193b表達水平顯著升高；bcr/abl融合基因及BCR/ABL蛋白表達水平明顯下調(diào)（P<0.05）；K562細胞增殖能力降低（P<0.05）；K562細胞凋亡水平明顯上升（P<0.05），caspase-3表達水平增高（P<0.01）。
　　結論:
　　1.成功構建Ad-pre-miR-193b重組腺病毒，并能高效感染K562細胞，實現(xiàn)miR-193b