2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構(gòu)建microRNA-193b(miR-193b)前體Ad-pre-miR-193b重組腺病毒載體,并鑒定其在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562中的表達(dá)水平,進(jìn)一步探討高效表達(dá)miR-193b對K562細(xì)胞的抑制效應(yīng)及其作用機制,為后續(xù)研究miR-193b在CML動物模型中的抗白血病效應(yīng)提供實驗依據(jù)。
  方法:
  1.化學(xué)合成miR-193b cDNA序列,克隆進(jìn)入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒,經(jīng)Pme I酶切線性

2、化后轉(zhuǎn)入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中進(jìn)行同源重組,獲得pAd-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒,再經(jīng)PacI線性化后轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中包裝、擴增。收集病毒后感染K562細(xì)胞(設(shè)為Ad-pre-miR-193b組),同時設(shè)空白組(K562細(xì)胞組)及空載病毒組(Ad組),采用QRT-PCR檢測K562細(xì)胞中miR-193b基因的表達(dá)水平。
  2.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感

3、染K562細(xì)胞,同時設(shè)空白組(K562細(xì)胞組)及空載病毒組(Ad組),采用QRT-PCR檢測miR-193b基因的表達(dá)水平;QRT-PCR和Western Blot分別檢測bcr/abl融合基因、BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)水平;CCK-8法檢測K562細(xì)胞的增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測K562細(xì)胞凋亡率。
  3.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感染K562細(xì)胞后,采用Western Blot檢測凋亡蛋白c

4、aspase-3的表達(dá)水平。
  結(jié)果:
  1.pAdTrack-CMV-pre-miR-193b重組穿梭質(zhì)粒和pAd-pre-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定及測序分析顯示構(gòu)建成功;重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中包裝成功,并能夠高效轉(zhuǎn)染 K562細(xì)胞;與對照組相比,QRT-PCR檢測顯示重組腺病毒載體感染K562細(xì)胞后其miR-193b基因表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)。
  2.與對照相比,

5、K562細(xì)胞在感染Ad-pre-miR-193b重組腺病毒后,其miR-193b表達(dá)水平顯著升高;bcr/abl融合基因及BCR/ABL蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05);K562細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05);K562細(xì)胞凋亡水平明顯上升(P<0.05),caspase-3表達(dá)水平增高(P<0.01)。
  結(jié)論:
  1.成功構(gòu)建Ad-pre-miR-193b重組腺病毒,并能高效感染K562細(xì)胞,實現(xiàn)miR-193b

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