重組腺病毒Ad-HAPO的高效制備和檢測.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:人促血液血管細胞生成素(Hemangiopoietin，HAPO)最初是我實驗室從再生障礙性貧血(AA)患者的尿液中分離純化出的一種新型細胞因子。序列分析表明HAPO與蛋白多糖4(proteoglycan 4，PRG4)具有很高同源性，其基因位于染色體iq24-25。體外試驗中，重組人HAPO(rhHAPO)能夠明顯促進人骨髓單個核細胞、CD34+、 CDl33+、KDR+和CD34+/KDR+細胞的造血/內(nèi)皮方向分化，并刺激

2、鼠長期培養(yǎng)起始細胞(LTC-ICs)的增殖；體內(nèi)試驗中，皮下注射重組人HAPO能夠明顯增加上下常小鼠骨髓造血細胞，同時也可以增加受照射小鼠的生存率。此外，最新的實驗表明，HAPO還可以通過P13K/AKT途徑抑制白血病細胞系MO7e凋亡。 目的:通過構(gòu)建表達HAPO基因的重組腺病毒，為進一步研究HAPO對血液干/祖細胞和血管內(nèi)皮細胞的促增殖作用奠定實驗基礎。 方法:從胚胎肝臟總RNA中擴增出HAPO基因后將其與鼠免疫球蛋

3、白信號肽Ig k相連，然后定向插入到穿梭質(zhì)粒pAd-track-CMV上，鑒定正確后，將pAd-track-CMV-HAPO與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細菌內(nèi)同源重組，獲得重組質(zhì)粒pAd-HAPO；采用脂質(zhì)體法pAd-HAPO轉(zhuǎn)染293A細胞進行包裝和擴增重組腺病毒。采用PCR和Western blot對重組腺病毒進行鑒定和檢測。 結(jié)果:PCR和測序分析顯示成功擴增出HAPO基因；重組質(zhì)粒pAd-HAPO轉(zhuǎn)染293

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