慢性髓細胞白血病細胞分泌的exosome的抗白血病作用研究.pdf

1、慢性髓細胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是一種起源于多能造血干細胞的惡性增生性疾病，目前尚無理想的根治手段。大量的臨床及實驗室證據表明，CML細胞具有免疫原性，能夠成為抗白血病細胞免疫治療的靶點。采用過繼性免疫治療，輸注抗白血病特異性細胞毒性T細胞，可以清除這些患者的殘留病灶。近年來，腫瘤細胞分泌的小囊泡exosome在腫瘤模型中發(fā)揮的免疫刺激功能引起了人們的廣泛關注。Exosome表達抗原呈遞相關分子，

2、帶有相關的腫瘤抗原信息，具有抗原提呈能力，使其有可能成為免疫治療中誘人的載體。 第一部分實驗，采用離心超濾和蔗糖密度梯度離心等方法分離出5例慢性髓細胞白血病慢性期患者CML細胞和K562細胞釋放的exosome，經透射電鏡觀察其超微結構。采用固相免疫電鏡法(solidphaseimmunoelectronmicroscopicmethod，SPIEM)制備CML-exosome的HSP70，ICAM-1及ABL免疫電鏡標本。采用

3、Westernblot方法檢測CML-exosome是否表達HSP70及MHC-Ⅰ。結果顯示：CML細胞及K562細胞分泌的exosome為直徑50～100nm的膜性微囊，圓形或橢圓形，腔內為低電子密度成分。CML-exosome經抗HSP70、ICAM-1和ABL抗體-膠體金免疫電鏡標記，囊外膜及腔內可見點狀、顆粒狀電子致密物沉積。Westernblot結果顯示CML-exosome中較白血病細胞凍融物(autogenous-leuk

4、emiccellslysates，ACL)含有更多的HSP70和MHC-Ⅰ。 第二部分實驗，為探討患者自體自血病細胞來源的exosome(CML-exosome)致敏CML患者外周血單個核細胞衍生的樹突狀細胞(CML-DC)，能否進一步提高細胞毒T細胞的殺傷活性。將CML患者的外周血單個核細胞，用IL-4、GM-CSF和TNF-α三種細胞因子聯(lián)合誘導培養(yǎng)出形態(tài)和表型為DC的細胞。采用MTT法檢測在效靶比為12.5∶1、25∶1、

5、50∶1時，T細胞+exosome-CML-DC組對CML靶細胞的殺傷率分別為(20.3±3.8)％、(32.9±3.4)％、(64.8±2.0)％，T細胞+CML-DC組分別為(12.8±1.7)％、(28.5±2.3)％、(38.7±2.2)％，二者比較有顯著性差異(P＜0.05)。以MTT法測定exosome-CML-DC和CML-DC對自體T細胞的促增殖活性。結果表明exosome致敏的CML-DC較CML-DC具有更強的激活C

6、TL的能力。 第三部分實驗，研究臍血樹突狀細胞(cordblooddendriticcell,CBDC)負載CML-exosome，是否可從臍血中誘導生成特異性殺傷CML白血病細胞的CTL細胞。常規(guī)方法從臍血單個核細胞誘導DC并分離T細胞，將CML-exosome致敏或白血病細胞凍融物(ACL)致敏的CBDC與T細胞共培養(yǎng)。流式細胞術分析細胞表型，MTT比色法檢測體外細胞毒活性，測定exosome-CBDC和ACL-CBDC對臍

7、血T細胞的促增殖活性。結果顯示：臍血樹突狀細胞同樣表達DC表面標志物CD1a、HLA-DR、CD83、CD86，具有典型DC的形態(tài)特征。在各效靶比下，exosome-CBDC激活的T細胞對白血病細胞的殺傷活性明顯強于ACL-CBDC激活的T細胞(P＜0.05)。在細胞毒性實驗中，以1例達完全細胞遺傳學反應后的CML患者的PBMNC作為靶細胞，觀察到exosome-CBDC激活的T細胞對非白血病細胞的低殺傷性。抗體阻斷實驗結果表明CD8+

8、T細胞是主要的效應細胞，細胞毒作用主要通過MHC-Ⅰ分子介導。 以上結果提示：(1)離心超濾和蔗糖密度梯度離心法純化小量exosome方法簡便可行。(2)CML-exosome表達ABL、HSP70、ICAM-1及MHC-Ⅰ分子，具有免疫原性，從而區(qū)別于細胞其他分泌產物。(3)CML-exosome致敏CML-DC能進一步提高CML-DC活化CTL的能力。(4)CML-exosome致敏臍血樹突狀細胞，可從臍血中誘導生成特異性殺