B亞群禽白血病病毒單克隆抗體的制備.pdf

1、禽白血病是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的一大病毒性腫瘤病，由于其亞型較多，分布廣泛，且垂直傳播，因而，對此病的防制和凈化有一定難度。在我國的地方品系雞群中，禽白血病感染呈現(xiàn)較為嚴(yán)重的狀態(tài)。相關(guān)研究學(xué)者在過去一段時(shí)期內(nèi)對禽白血病研究偏向于致病性較強(qiáng)的J亞群病毒，而忽略了經(jīng)典的A/B亞群病毒，這間接的造成了本已存在于我國地方品系雞群中A/B亞群禽白血病病毒的泛濫。凈化地方品系雞群中A/B亞群禽白血病病毒，成為了當(dāng)務(wù)之急，研制針對性的單克隆抗體，建立標(biāo)準(zhǔn)化

2、檢測試劑盒，實(shí)現(xiàn)對疾病快速而準(zhǔn)確地監(jiān)控，是需首要完成的任務(wù)。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在制備針對B亞群禽白血病病毒的單克隆抗體。首先，利用IDEXX公司的AB亞群禽白血病病毒抗體檢測試劑盒對山東某地方壽光雞場雞群進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示抗體陽性率達(dá)70.37％(95/135)。剖檢病雞，觀察臟器病理變化，無菌采取表面有肉眼看見腫瘤結(jié)節(jié)的肝臟、脾臟等臟器，制備組織切片進(jìn)行觀察。將病料凍存于超低溫冰箱，作為提取病毒和前病毒DNA的病料。
　　利用

3、病雞脾臟提取病毒液，并接種于DF-1細(xì)胞擴(kuò)增病毒。用p27抗原檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清，確定病毒存在，并命名為ALV-B-SG12，于超低溫冰箱凍存病毒液。采用寶生物公司DNAiso Reagent基因組DNA提取試劑處理病料，進(jìn)行前病毒DNA的提取，以獲取目的基因。區(qū)分禽白血病病毒不同亞群的主要依據(jù)為gp85囊膜蛋白，不同亞群gp85基因序列的差異性決定了病毒囊膜蛋白的抗原特異性。針對ALV-B的gp85基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增、回收和測

4、序。結(jié)果顯示1038bp測準(zhǔn)。與國內(nèi)外報(bào)道的12株ALV-A同源率在85％左右，與6株ALV-B的同源率達(dá)90％以上，其中與RAV-2、WB11080、RSV-SCHMIDT-RUPPIN B以及JS-B1203四株的同源性高達(dá)96％以上。
　　將回收產(chǎn)物連接入pET32a載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21大腸桿菌原核表達(dá)菌株，進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件，從IPTG濃度、溫度和時(shí)間三個(gè)方面進(jìn)行試驗(yàn)，對每次試驗(yàn)進(jìn)行SDS-PAGE檢測。最終

5、確定最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為:IPTG濃度0.1 mmol/L、溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)間8h。超聲裂解菌液，過Ni柱純化后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，在53kDa處有明顯條帶。用TGE透析液進(jìn)行純化蛋白的復(fù)性，最終生產(chǎn)出可以作為特異性免疫原的活性蛋白。
　　在獲得純化蛋白后，首先建立間接ELISA檢測方法，通過一系列對比試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)條件為抗原包被濃度3μg/ml、血清稀釋度為1∶1000、二抗的稀釋比例為1∶2000。于1、15、30d

6、免疫若干BALB/c小鼠，免疫量50μg純化蛋白每只每次，尾靜脈采集血液，分離血清，用建立好的方法進(jìn)行檢測，顯示效價(jià)均高達(dá)1∶26～29。取三免后加強(qiáng)免一次的小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞按3～5∶1進(jìn)行細(xì)胞融合，前后共進(jìn)行八次細(xì)胞融合工作，最終通過間接ELISA方法檢測出陽性孔。對陽性孔進(jìn)行擴(kuò)增和凍存，并取部分陽性孔細(xì)胞利用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，篩選出單克隆的陽性細(xì)胞株。利用單克隆抗體進(jìn)行IFA檢測，以及抗體分泌穩(wěn)定性試驗(yàn)，可得所制備的