PFH-Fe3O4@PLGA多功能相變型高分子造影劑MRI-US雙模態(tài)顯像及光熱治療實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分.載Fe3O4及液態(tài)氟碳多功能相變型高分子造影劑的制備及性能檢測(cè)
　　目的:以高分子材料聚乳酸-羥基乙酸（Poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA）為外殼，液態(tài)全氟己烷（Perfluorohexane,PFH）為內(nèi)核，超順磁性四氧化三鐵納米顆粒（Ferriferrous oxide,Fe3O4）分布于殼層中，制備一種磁性相變型多功能納米乳液造影劑（PFH/Fe3O4@PLGA），檢測(cè)其一般特性，并

2、通過體外實(shí)驗(yàn)觀察其相變能力。
　　方法:采用單乳化法制備載Fe3O4同時(shí)包裹PFH的高分子PFH/Fe3O4@PLGA納米粒,另外分別制備單純載Fe3O4納米粒的Fe3O4@PLGA納米粒、單純包裹PFH的PFH@PLGA納米粒以及空白PLGA納米粒為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。對(duì)其表面形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、粒徑、電位等一般特性進(jìn)行檢測(cè)；用原子吸收光譜法測(cè)量不同濃度PFH/Fe3O4@PLGA納米粒溶液中的Fe濃度。然后用升溫及近紅外光輻照兩種方法于體

3、外激發(fā)納米粒相變，并于顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察整個(gè)PFH/Fe3O4@PLGA乳液發(fā)生相變的過程，探討促發(fā)其發(fā)生相變的可行性。
　　結(jié)果: PFH/Fe3O4@PLGA溶于雙蒸水后呈棕色乳液，光鏡及掃描電鏡下觀察PFH/Fe3O4@PLGA呈球形，形態(tài)規(guī)則，大小尚均勻，分散度好，表面尚光滑。透射電鏡觀察PFH/Fe3O4@PLGA呈殼核結(jié)構(gòu)，外面為高分子殼層，大量致密金屬Fe3O4顆粒較均勻分布于納米殼層結(jié)構(gòu)中，中心為液態(tài) PFH構(gòu)成的內(nèi)

4、核。Malvern激光粒徑儀檢測(cè)出PFH/Fe3O4@PLGA平均直徑為（347±61.83nm）nm， Zeta電位為(?25.2±7.25)mV。原子吸收光譜法測(cè)量不同濃度PFH/Fe3O4@PLGA納米粒溶液（2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，160μg/mL，320μg/mL，640μg/mL，280μg/mL）中的Fe濃度分別為0.64±0.09μg/mL，1.39

5、±0.09μg/mL，2.66±0.30μg/mL，5.378±0.68μg/mL，10.76±1.26μg/mL，21.49±0.75μg/mL，30.0±1.27μg/mL，55.55±1.24μg/mL，117.11±2.10μg/mL，247.30±1.68μg/mL。當(dāng)溫度升高至一定程度或近紅外光輻照，均可促發(fā)納米粒發(fā)生相變，顯微鏡下可見相變后產(chǎn)生的微泡。
　　結(jié)論:成功制備了PFH/Fe3O4@PLGA多功能納米乳液，

6、形態(tài)規(guī)則、呈球形，大小均勻，性質(zhì)穩(wěn)定的。該造影劑具有良好液氣相變能力及磁性能，具備超聲及磁共振成像的潛能，在升溫及近紅外光輻照的誘發(fā)下可促發(fā)相變，是一種多功能造影劑。
　　第二部分.PFH/Fe3O4@PLGA多功能相變型高分子造影劑增強(qiáng)超聲及核磁顯像實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察PFH/Fe3O4@PLGA增強(qiáng)磁共振成像的效果；并于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察PFH/Fe3O4@PLGA發(fā)生相變后對(duì)超聲顯影的增強(qiáng)效應(yīng)，初步探討其

7、增強(qiáng)顯像機(jī)制。
　　方法:制備體外核磁成像模型，應(yīng)用磁共振掃描儀對(duì)不同濃度的納米粒溶液行MR掃描測(cè)量其信號(hào)強(qiáng)度并用原子吸收光譜法測(cè)量各樣品中Fe濃度。體內(nèi)核磁顯影實(shí)驗(yàn)，取裸鼠10只分成兩組分別經(jīng)尾靜脈注入空白PLGA及PFH/Fe3O4@PLGA納米溶液（濃度320μg/ml，體質(zhì)量1ml/kg），注射前后行MR平掃及增強(qiáng)掃描，分別測(cè)量注射前后肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度值的變化。體外超聲顯影實(shí)驗(yàn)，將1mL PFH/Fe3O4@PLGA（320

8、μg/ml）納米溶液通過注射器注入透明橡膠微細(xì)管（內(nèi)徑約2mm），于體外用升溫及近紅外光輻照兩種方式促發(fā)PFH/Fe3O4@PLGA相變，觀察納米乳液相變后對(duì)超聲顯像的增強(qiáng)作用。體內(nèi)超聲顯影實(shí)驗(yàn)，24只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成四組,用注射器在每組裸鼠腫瘤部位皮下注射0.2 ml等濃度(320μg/mL)的相應(yīng)的納米溶液（I：PLGA，II：PFH@PLGA, III：Fe3O4@PLGA，IV：PFH/Fe3O4@PLGA），按摩1min。在近

9、紅外光下進(jìn)行輻照，觀察輻照過程腫瘤處超聲顯影的增強(qiáng)情況。
　　結(jié)果:在體外核磁共振T2*加權(quán)成像顯像中，不同濃度的PFH/Fe3O4@PLGA均表現(xiàn)出明顯負(fù)性增強(qiáng)顯像，且信號(hào)強(qiáng)度隨納米溶液內(nèi)Fe3O4濃度的升高而下降。體內(nèi)裸鼠肝臟MR成像顯示，注射PFH/Fe3O4@PLGA后，肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度顯著下降。體外超聲顯影實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)溫度升高超過50℃、或近紅外光輻照后，均能促進(jìn)PFH/Fe3O4@PLGA發(fā)生相變產(chǎn)生微泡，并在造影下可見明

10、顯的超聲增強(qiáng)顯影。體內(nèi)超聲顯影實(shí)驗(yàn)中，近紅外光輻照后實(shí)驗(yàn)組IV(PFH/Fe3O4@PLGA)在超聲對(duì)比增強(qiáng)模式下明顯增強(qiáng)超聲顯影，對(duì)照組(I-III)未見明顯顯影。
　　結(jié)論:PFH/Fe3O4@PLGA在體內(nèi)外均具有增強(qiáng)磁共振顯像的能力，且在升溫及近紅外光輻照時(shí)可以發(fā)生相變，從而增強(qiáng)超聲顯影，具備成為多模態(tài)影像學(xué)對(duì)比劑的潛能。
　　第三部分.近紅外光聯(lián)合PFH/Fe3O4@PLGA納米乳劑增效光熱治療實(shí)驗(yàn)研究
　　

11、目的:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察近紅外光聯(lián)合PFH/Fe3O4@PLGA對(duì)腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織的破壞作用，探討PFH/Fe3O4@PLGA對(duì)近紅外光熱消融的增效作用及實(shí)現(xiàn)光熱治療的機(jī)制，研究其作為集診斷與治療于一體的多功能造影劑的潛力及可行性。
　　方法:體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，設(shè)置不同分組來探究近紅外光輻照時(shí)間及距離的不同而引起的溫度變化及對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響，通過細(xì)胞凋亡率得出最佳輻照時(shí)間及距離。另外以Fe3O4@PLGA、PFH@P

12、LGA、PLGA為對(duì)照，來驗(yàn)證PFH/Fe3O4@PLGA對(duì)近紅外光熱消融體外腫瘤細(xì)胞的增效作用。建立裸鼠SKOV3人卵巢癌移植瘤模型36只，于腫瘤種植后20-30天，隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組（I），單純近紅外輻照組（II），PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（III），PFH@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（IV），F(xiàn)e3O4@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（V），PFH/Fe3O4@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（VI）。分別于組III-VI荷瘤裸鼠腫瘤部位局

13、部注射0.2mL(320μg/mL)相應(yīng)的納米粒溶液，局部按摩1min。組II-VI裸鼠均接受紅外光輻照（波長0.78-2.8μm，時(shí)間12min，距離15cm），并且進(jìn)行兩次輻照。近紅外光輻照結(jié)束后24小時(shí)，取下裸鼠腫瘤組織，采集標(biāo)本行HE染色、普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞增殖及凋亡檢測(cè)及透射電鏡觀察。
　　結(jié)果:由體外細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，近紅外光輻照溫度隨著時(shí)間的延長而升高，隨著輻照距離的增加而下降，而輻照溫度越高，細(xì)胞凋亡率越高。從溫

14、度與凋亡率的關(guān)系中可得到較適宜的輻照距離為15cm，輻照時(shí)間為5min。體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)比不同的納米粒聯(lián)合近紅外光對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的不同影響，可驗(yàn)證Fe3O4/PFH@PLGA對(duì)近紅外光熱消融體外腫瘤細(xì)胞起到明顯的增效作用。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中, HE染色顯示PFH/Fe3O4@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞，細(xì)胞膜及核膜碎裂溶解。免疫組化檢測(cè)可見大量凋亡腫瘤細(xì)胞，其凋亡指數(shù)明顯高于其他各組，增殖指數(shù)卻明顯低于其他各組（P<0.05）

15、。電鏡觀察見部分腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞膜和核膜失去連續(xù)性，染色質(zhì)固縮、碎裂呈團(tuán)塊狀，部分細(xì)胞器溶解消失，可見胞漿中有黑色Fe顆粒沉積。
　　結(jié)論:PFH/Fe3O4@PLGA納米材料內(nèi)包裹的Fe3O4在近紅外光輻照下能夠吸收近紅外光，將光能轉(zhuǎn)換為熱能，從而激發(fā)其內(nèi)的液態(tài)PFH產(chǎn)生相變。近紅外光的光熱效應(yīng)和相變產(chǎn)生的空化及熱膨脹效應(yīng)能夠有效增強(qiáng)近紅外光對(duì)體外腫瘤細(xì)胞及體內(nèi)裸鼠腫瘤組織的熱消融作用，破壞腫瘤細(xì)胞及組織，增加細(xì)胞凋亡率