兔跟腱急性損傷修復(fù)術(shù)后持續(xù)牽張應(yīng)力刺激促進肌腱修復(fù)及其作用機理研究.pdf

1、肌腱是連接骨和肌肉的致密結(jié)締組織，其在肌肉和骨之間具有傳遞動能的作用，由于肌腱細胞周圍包裹有縱行排列的膠原纖維束，因此肌腱具有較強的抗拉強度。但是肌腱組織鑒于這種力學(xué)強度較高的組織結(jié)構(gòu)，其血管比例較少，因此損傷后不利于組織的修復(fù)和再生。臨床上治療肌腱急性斷裂或損傷常常采用外科手術(shù)來修復(fù)。隨著縫合方法的不斷改進，以及縫合材料的迅猛發(fā)展，肌腱縫合后的再斷裂率顯著下降。但對于肌腱損傷修復(fù)后的固定方法，以往的臨床經(jīng)驗則是采用非功能位的固定，即松

2、弛位，主要考慮到縫合后早期受力會使得縫合處的肌腱再斷裂或者近端和遠端鏈接較差。但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，功能位固定的提出也是對傳統(tǒng)方法的一種挑戰(zhàn)。功能位固定使得肌腱修復(fù)后處于持續(xù)的溫和牽張刺激中。以往的實驗研究表明，體外離體對跟腱、髕腱等進行牽拉刺激后，其膠原含量較未施加牽拉刺激的水平高。那么功能位固定的這種能夠?qū)π迯?fù)后的肌腱產(chǎn)生持續(xù)牽張應(yīng)力刺激能否對肌腱的修復(fù)帶來益處，它加速肌腱組織修復(fù)的機制則是本文研究的重點。闡明其潛在的機理，有利于將

3、功能位固定更廣泛的應(yīng)用于肌腱損傷修復(fù)后，為臨床提供新的治療方法和手段。
　　目的:
　　探討兔跟腱急性離斷修復(fù)后功能位固定對其修復(fù)效果的影響以及其潛在的作用機理。
　　方法:
　　本研究分兩部分進行。第一部分為探討兔跟腱急性損傷修復(fù)術(shù)后持續(xù)牽張應(yīng)力刺激對跟腱的生物力學(xué)和相關(guān)生長因子表達影響。第二部分為探討持續(xù)牽張應(yīng)力刺激對肌腱干細胞向肌腱細胞定向分化的研究。
　　第一部分，研究對象為成年健康雄性新西蘭白兔，

4、隨機分為4組，每組42只，即A、B、C和D組。A組給予跟腱離斷縫合術(shù)后踝關(guān)節(jié)功能位固定。B組給予松弛位固定。C組不給于固定，自由活動。D組為正常對照組。選擇術(shù)后第7d、14d、28d三個時間點檢測各組兔跟腱修復(fù)組織力學(xué)性能，HE、苦味酸-－天狼猩紅染色觀察修復(fù)的肌腱組織形態(tài)及膠原分布，彩超觀察各組跟腱組織的術(shù)后7d，14d和28d的相關(guān)指標(biāo)。透射電鏡觀察各組跟腱組織術(shù)后28d時的超微結(jié)構(gòu)。采用實時定量PCR和ELISA法檢測修復(fù)肌腱組織

5、的相關(guān)基因和蛋白的水平。第二部分，體外分離培養(yǎng)兔跟腱肌腱干細胞，采用成骨、成軟骨、成脂肪等誘導(dǎo)液進行誘導(dǎo)并染色鑒定其多向分化潛能。采用流式細胞術(shù)檢測分離的肌腱干細胞特征性蛋白水平。采用持續(xù)牽張應(yīng)力刺激儀對體外分離培養(yǎng)的肌腱干細胞進行2％strain、4% strain和6% strain的持續(xù)牽張應(yīng)力刺激。在施加刺激后24h和48h時檢測細胞成肌腱分化相關(guān)基因和蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分，術(shù)后28d時A組跟腱損

6、傷處可見大量膠原纖維形成，纖維排列較整齊，炎性細胞較少見到。C組兔跟腱修復(fù)處也可見有大量膠原纖維形成，纖維結(jié)構(gòu)排列比A組較差。術(shù)后第7d、14、28d時，四組兔跟腱最大載荷、抗拉剛度、最大斷裂應(yīng)力差異均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），A組均優(yōu)于B組和C組（P＜0.05）。第28d時A組最大載荷、抗拉剛度、最大斷裂應(yīng)力的值分別為269.32±28.43(N)，25.63±1.43(N/mm)和9.78±2.53（Mpa）。在第28d時，A

7、組兔跟腱Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例均已非常接近正常兔跟腱，然而 C組的Ⅰ型膠原比例略低于A組，B組最低，僅為86.32%。術(shù)后第7d時，A組兔跟腱組織中，COL I、COLⅢ、TGF-β1、bFGF、PDGF和IGF-1基因表達水平顯著升高。高于B組、C組和D組，而A組VEGF表達量較B組和C組低（P＜0.05）。在術(shù)后第28d時，各組COL I、COLⅢ、TGF-β1、bFGF、PDGF、VEGF和IGF-1基因表達水平均有不同程度的下

8、降，但仍高于D組水平（P＜0.05）。ELISA檢測蛋白水平結(jié)果顯示術(shù)后第7d時，A組COL I、TGF-β1、bFGF、PDGF蛋白水平顯著高于B組和C組（P＜0.05）。而四組VEGF和IGF-1蛋白水平差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后第14d時，A組和C組COL I、bFGF和PDGF蛋白水平又有所上升，且顯著高于B組（P＜0.05）。
　　第二部分，肌腱干細胞呈鵝卵石樣平鋪于培養(yǎng)瓶底，并且呈克隆樣生長。番紅O、茜素

9、紅和油紅O染色顯示肌腱干細胞具有向成軟骨、成骨和成脂分化的潛能。2%牽張應(yīng)力下，肌腱干細胞在24h時I型膠原和Ⅲ型膠原基因表達有明顯的上升，然而在48h時，其這兩個基因表達未見明顯變化（P＞0.05），而TNC和SCX兩個肌腱細胞標(biāo)志性基因及蛋白在48h時反而表達水平下降。在4%持續(xù)牽張應(yīng)力刺激下COL I、COLⅢ、TNC和 SCX均有顯著的上升，并且48h時表達水平也高于24h時（P＜0.05）。而6%的持續(xù)牽張應(yīng)力刺激未能使肌腱干

10、細胞的COL I、COLⅢ、TNC和 SCX基因及蛋白表達顯著升高，顯著低于2%和4%持續(xù)牽張應(yīng)立組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、兔跟腱急性斷裂修復(fù)后功能位固定較非功能位固定更能夠促進肌腱組織膠原含量的增加以及纖維結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。
　　2、兔跟腱急性斷裂修復(fù)后功能位固定較非功能位固定更能夠促進修復(fù)跟腱組織生物力學(xué)性能的提高。
　　3、兔跟腱急性斷裂修復(fù)后功能位固定較非功能位固定更能夠促進修復(fù)跟腱組織的肌腱相