適度牽伸應(yīng)力對老齡大鼠TSCs的作用及其對肌腱損傷修復(fù)作用研究.pdf

1、研究背景：
　　肌腱為連接著肌肉和骨的結(jié)締組織，其將肌肉收縮產(chǎn)生的力傳導(dǎo)至骨，產(chǎn)生運(yùn)動并維持著靜息狀態(tài)時姿勢。肌腱因為經(jīng)常承受著牽伸負(fù)荷容易導(dǎo)致肌腱纖維微損傷，最終導(dǎo)致肌腱病。老齡化已經(jīng)被證實為肌腱病的一個重要影響因素，另外老齡化還導(dǎo)致肌腱損傷后修復(fù)困難以及修復(fù)后不能達(dá)到正常的力學(xué)性質(zhì)和功能狀態(tài)。當(dāng)前針對老齡化導(dǎo)致的肌腱病治療選擇相當(dāng)有限并且往往臨床效果不佳，主要原因是對老齡化導(dǎo)致的肌腱病的認(rèn)識仍有待深入。既往研究已經(jīng)揭示了一些老

2、齡化肌腱的結(jié)構(gòu)改變以及發(fā)病的分子機(jī)制，然而老齡化肌腱中肌腱干細(xì)胞如何變化，以及適度機(jī)械牽伸對老齡化肌腱損傷的愈合究竟起何作用仍沒有定論。本研究的目的是嘗試通過明確老齡化肌腱干細(xì)胞的特性，研究適度體外牽伸和適度跑臺訓(xùn)練對老齡化肌腱干細(xì)胞的影響，探討適度適度跑臺訓(xùn)練對老齡化肌腱損傷愈合的作用，最終能夠為老齡化肌腱病的臨床治療提供一些線索和啟示。
　　材料與方法：
　　24只20月齡Fisher雌性老齡大鼠和6只2月齡Fisher

3、雌性成年大鼠被應(yīng)用于本課題研究。首先老齡大鼠和成年大鼠各6只用以比較老齡和成年大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞干性、增殖能力和分化特征的差異;然后我們比較觀察了老齡大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞在4％適度牽伸后肌腱干細(xì)胞發(fā)生的變化;接著18只老齡大鼠被隨機(jī)分配至適度跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組，每組各9只。第1周老齡大鼠跑臺訓(xùn)練方案為:13米/分鐘，15分鐘/天，5天/周;第2-4周老齡大鼠跑臺訓(xùn)練方案為:13米/分鐘，30分鐘/天，15分鐘/天，5天/周

4、。老齡大鼠跑臺訓(xùn)練結(jié)束后，每組各3只老齡大鼠處死用以獲得肌腱干細(xì)胞并首先用以比較肌腱干細(xì)胞各種特性。每組剩下6只老齡大鼠被用以制作髕腱缺損模型，并分別在模型制作結(jié)束后第4周和第8周處死老齡大鼠用以評價肌腱缺損愈合情況。
　　結(jié)果：
　　1.老齡化肌腱干細(xì)胞的特征。
　　我們首先對老齡化肌腱干細(xì)胞進(jìn)行了干細(xì)胞表面標(biāo)記流式分析和核內(nèi)標(biāo)記的免疫熒光染色鑒定。結(jié)果顯示:老齡化髕腱來源肌腱干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、Stro-1和

5、SSEA-1表達(dá)陽性;而CD34、CD45、CD44、CD31表達(dá)陰性。老齡化髕腱來源肌腱干細(xì)胞核內(nèi)干細(xì)胞標(biāo)記物OCT-4、NS和Nanog表達(dá)陽性。
　　2.老齡化弱化了大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞的增殖和自我更新能力。
　　孵箱孵育10-16天后，倒置光顯微鏡下分別可見老齡大鼠和成年大鼠肌腱干細(xì)胞克隆。老齡大鼠髕腱克隆來源的肌腱干細(xì)胞P0形態(tài)不均一，肌腱干細(xì)胞向心性較弱，細(xì)胞核渾濁不明顯;而成年大鼠髕腱來源的肌腱干細(xì)胞P0形態(tài)

6、均一，多呈四邊形;細(xì)胞呈中央向心性排列。與成年大鼠髕腱來源的肌腱干細(xì)胞P0相比，老齡大鼠老齡大鼠髕腱來源的肌腱干細(xì)胞P0細(xì)胞形態(tài)更加細(xì)長，多變而不均一，細(xì)胞核大而不明顯，排列更加紊亂。老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞皆表達(dá)CD90，統(tǒng)計結(jié)果顯示成年大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞CD90表達(dá)陽性率要高于老齡大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞，兩者有顯著性差異。老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞OCT-4，Nanog，NS免疫染色均陽性。老齡大鼠髕腱來源

7、肌腱干細(xì)胞的PDT為34.9±1.4h;而成年大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞的PDT為23.9±0.8h，兩者具有顯著性差異(p＜0.01)。老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源的肌腱干細(xì)胞孵育24小時的平均OD分別為:0.62±0.04;0.47±0.05;兩者具有顯著性差異(P=0.002);老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源的肌腱干細(xì)胞孵育48小時的平均OD分別為:0.73±0.03，0.54±0.03，兩者具有顯著性差異(P=0.004)。老齡大鼠髕腱來

8、源肌腱干細(xì)胞P1 ColⅠ，LPL，ColⅡ和Osteocalcin表達(dá)分別為成年大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞P1表達(dá)的0.4，2.1，1.5和5.6倍。
　　3.體外適度牽伸和適度跑臺訓(xùn)練增強(qiáng)老齡肌腱干細(xì)胞的克隆和增殖能力，并誘導(dǎo)老齡肌腱干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化。
　　老齡大鼠髕腱來源的肌腱干細(xì)胞在4％機(jī)械牽伸后，其核內(nèi)干細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記OCT-4，Nanog和NS表達(dá)增加;肌腱干細(xì)胞的增殖也顯著增加。老齡大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞P1在4

9、％機(jī)械牽伸24小時后，RT-PCR結(jié)果顯示:COⅠⅠ，COLⅡ，LPL和Osteocalcin表達(dá)分別為未牽伸組的4.14倍，0.27倍，0.23倍，0.70倍。
　　適度跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組老齡大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞都能形成克隆，然而跑臺組老齡大鼠髕腱來源肌腱干細(xì)胞形成的克隆數(shù)目更多，直徑更大;而且肌腱干細(xì)胞的形態(tài)變得均一。適度跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠TSCs的增殖能力增加了31％(p＜0.01); OD值增加了10％(p=0.

10、04)。流式分析結(jié)果顯示:適度跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠肌腱干細(xì)胞SSEA-1和Stro-1陽性率分別為對照組的2.46倍和6.25倍。另外qRT-PCR結(jié)果顯示:適度跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠OCT-4和Nanog的表達(dá)分別為籠中自由活動組的4.17倍和3.23倍;而適度跑臺訓(xùn)練組組老齡大鼠肌腱干細(xì)胞ColⅠ，Sox-9，PPAR和Runx-2分別為對照組3.50倍，0.01倍，0.27倍和0.13倍，具有顯著性差異。
　　4.適度跑臺訓(xùn)練增強(qiáng)

11、了老齡大鼠肌腱愈合能力。
　　我們成功制備了跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組老齡大鼠髕腱缺損模型。老齡大鼠髕腱缺損模型制作4周后，取髕腱組織并行HE染色，結(jié)果顯示:跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組兩組老齡大鼠髕腱缺損模型都未完全愈合，而籠中自由活動組髕腱缺損較之跑臺訓(xùn)練組明顯。老齡大鼠髕腱缺損模型制作8周后，大體觀跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠的髕腱缺損已消失，而籠中自由活動組仍較明顯;髕腱組織HE染色結(jié)果顯示:跑臺訓(xùn)練組髕腱缺損已被較多增殖肌腱細(xì)胞填充

12、，且肌腱纖維排列較整齊;而籠中自由活動組原髕腱仍可見空白區(qū)以及排列紊亂的肌腱纖維。免疫組化結(jié)果證實跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠的髕腱缺損區(qū)有較多新生的膠原組織。
　　結(jié)論：
　　老齡化髕腱來源肌腱干細(xì)胞的干性降低，并且其增殖能力，克隆能力都顯著下降;老齡化肌腱干細(xì)胞更易于向非肌腱細(xì)胞分化。體外適度牽伸和適度跑臺訓(xùn)練增強(qiáng)了老齡化肌腱干細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)老齡化肌腱干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化，說明其可以有效對抗老齡化對肌腱干細(xì)胞的不利影響;適