珍珠膜海綿共附生微生物PKS與NRPS的篩選與模塊結構研究.pdf

1、本論文從開發(fā)海洋藥物及探詢藥源問題出發(fā)，針對我國沿海特殊來源的微生物——海洋生物附生細菌開展了一系列的探索性研究。我們通過抗菌、細胞毒的篩選，從分離到的364株海洋細菌中獲得42株具有抗菌活性的海洋細菌，12株具有細胞毒活性的海洋細菌。對12株具有細胞毒活性的細菌菌株進行了16SrRNA系統(tǒng)發(fā)生學分析，它們分別屬于Agrobacterium，Pseudoalteromons，Bacillus，Paracoccus,Rheinheimer

2、a,Aerococcus,Exiguobacterium和Alteromonas8個屬。同時，對這12株具有細胞毒活性的細菌菌株進行進一步的多聚酮合酶(PKS Ⅰ型)和非核糖體肽合成酶(NRPS)的篩選，得到了4株含有PKS Ⅰ型的KS結構域或NPRS的A結構域的海洋細菌，為從聚酮和非核糖體肽等生物合成途徑去深入研究其次生代謝產物提供了基因學的證據(jù)。
　　 以海洋微生物Pseudoalteromons sp.NJ632作為研究對

3、象，運用Genome-walking策略對已獲得KS片段的上、下游區(qū)域進行了部分的步移得到了一段約為10 Kb大小的連續(xù)的核苷酸序列，對其中疑似PKS的開放閱讀框(ORF)進行了PKS模件中結構域的分析。結果顯示，我們獲得了包括ketosynthase(KS)，acyltransferase(AT)，dehydratase(DH)， ketoreductase(KR)， cyclization(Cy)在內的一個相對完整的PKS模件。在我

4、們獲得的PKS模件的結構中，除了常見的PKS相關結構域外，還發(fā)現(xiàn)了結構域cyclization(Cy)，這在以往的報道中極少見到。這也暗示在NJ6-3-2中有可能存在一個PKS/NRPS雜合的，且結構非常特殊的雜合基因簇。
　　 以海洋微生物Pseudoalteromons sp.NJ631作為研究對象，首次成功的構建并保存了其基因組文庫，并對文庫質量做了相應的鑒定，保證了文庫的完整性。在此基礎上，進一步用來自于其本身的酮基合酶

5、基因(KS)制備探針，對2880個單克隆進行了雜交篩選，獲得了14個陽性克隆子，分別標記為：AE1，BG2，CA1，CB6，DD12，DH5，F(xiàn)A11，GC10，GD7，GG4，KG10，LD8，MH9，OA5。運用“染色體步移”策略，對這14個陽性重組子上所插入的NJ6-3-1的基因組DNA片段進行簡單的排序，并結合相應的酶切片段，最終確定，陽性克隆子BG2，GG4最有可能是14個陽性克隆子最外側的兩個克隆子，采用鳥槍法(Shot G

6、un Sequencing)對陽性克隆子BG2，GG4進行了大片段測序，獲得了一條約為60 Kb的，連續(xù)的DNA序列。通過生物信息學分析，對其中所包含的20個開放閱讀框(ORF)進行了逐一的功能注釋。對疑似PKS或NRPS的三個ORF(ORF14，ORF15和ORF19)運用在線軟件“NPRS-PKS"對其PKS或NRPS的結構域進行了預測。最終，獲得了一個包括終止結構域“TE”在內的，由7個連續(xù)模件組成的，完整的，NRPS/PKS雜合

7、生物合成基因簇，命名為“NJ631 NPRS-PKS生物合成基因簇”。運用NRPS A結構域底物特異性預測法則，我們成功的對獲得的NJ631NRPS/PKS雜合生物合成基因簇中4個A結構域(A2，A3，A4，A5)進行了其各自的特異性底物的預測。結果顯示，4個A結構域(A2，A3，A4，A5)各自特異性結合的氨基酸為：Glu/Gln，Ser，Ser-D，Aeo。
　　 為了制備Pseudoalteromons sp.NJ63 l

8、的NRPS-PKS基因簇中KS結構域的特異性抗體，同時也進行A結構域的底物特異性酶活檢測，我們采用已商品化的pET表達系統(tǒng)(pET-28a)構建了分別含有KS、A1、A2、A3、A4、A5結構域的表達質粒pZPKS2、pZPA12、pZPA22、 pZPA32、pZPA42、pZPA52。異源表達結果顯示，我們成功的在大腸桿菌BL21(DE3)中超量表達了KS、A1、A3和A4結構域，為今后的KS結構域的特異性抗體制備和A結構域的底物特

9、異性酶活檢測提供了必要條件。
　　 本論文從海洋生物附生微生物的分離開始，進行了其代謝產物生物活性(抗菌、細胞毒)和功能基因(PKS、NRPS)篩選以及活性菌株的分子鑒定：運用Genome-walking策略對分離得到的活性菌Pseudoalteromons sp.NJ632中的PKS模件進行了初步的研究，同時，通過文庫構建、篩選、測序，采用反向遺傳學的手段初步揭示了活性菌Pseudoalteromons sp.NJ631中存在

10、一個NRPS/PKS雜合的生物合成途徑，并對合成途徑中的A結構域的底物特異性進行了預測；最后，對獲得的“NJ631 NRPS-PKS生物合成途徑”中的核心結構域進行了異源表達的嘗試。這項工作不僅完善了一套進行海洋微生物活性天然產物研究的系統(tǒng)方法，為開發(fā)具有藥用潛力的天然化合物建立模型，也為海洋微生物作為海洋活性物質的藥源提供新的依據(jù)。本工作在海洋微生物活性天然產物的研究中盡管尚處于初級階段，但在整個課題的研究中取得了實質性進展，對后續(xù)研