海綿共附生微生物脂肪酶產(chǎn)生菌篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)及基因克隆研究.pdf

1、脂肪酶的應(yīng)用廣泛,且需求量很大。尋找新型脂肪酶是脂肪酶研究和應(yīng)用的重要內(nèi)容。海洋微生物是海洋生物酶開(kāi)發(fā)的重要資源。本文以海綿共附生微生物脂肪酶為對(duì)象,開(kāi)展菌種篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)及基因克隆研究,為進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。迄今為止,尚未有海綿共附生微生物來(lái)源的脂肪酶方面的報(bào)道。對(duì)44株分離自我國(guó)南海的細(xì)薄星芒海綿Stelletta tenuis、皺皮軟海綿Halichondria regosa、澳大利亞厚皮海綿Craniella aus

2、traliensis細(xì)菌進(jìn)行了脂肪酶篩選,發(fā)現(xiàn)大多(29/44)具有脂肪酶活性。選擇具有較強(qiáng)脂肪酶活性的3株活性菌株A40、B22、B106進(jìn)行進(jìn)一步研究。經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定,三株細(xì)菌分別為Pseudomonas sp. A40、Bacillus sp. B22、Bacillus pumilus B106。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)酶研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌B106具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力,在接種35h后達(dá)到最大細(xì)胞濃度為6.38g/L；接種

3、45h后,發(fā)酵液中總酶活在45h達(dá)到最大值為25.28U/ml,A40和B22分別在接種55h后達(dá)到最大值,酶活分別為11.11U/ml和8.98U/ml；B106的酶活分別為A40和B22的2.28和2.81倍。選擇短小芽孢桿菌B106進(jìn)行下一步的培養(yǎng)基優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)與基因克隆研究。通過(guò)單因素分析和Plackett-Burman設(shè)計(jì)等多種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法相結(jié)合,優(yōu)化了短小芽孢桿菌B106產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)基,確定此細(xì)菌最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：

4、tween80 (5.0ml L-1), Mg2+ (17.15 gL-1), PO43- (2.0 gL-1), yeast extract (5.0 gL-1)和maize oil (12.5 ml L-1),beef extract (5 gL-1)和CaCl2 (2.282 gL-1)。起始pH值7.0,5%接種量,28℃,180rpm,發(fā)酵液中的脂肪酶酶活值在60h最高可達(dá)86.37U/ml,細(xì)胞干重在55h最高為7.44 g

5、L-1,比發(fā)酵基本培養(yǎng)基分別提高3.54和1.31倍。對(duì)發(fā)酵液粗酶性質(zhì)進(jìn)行的初步研究發(fā)現(xiàn),短小芽孢桿菌B106脂肪酶的最適酶反應(yīng)溫度為50℃；最適酶反應(yīng)pH值為8.0；在0-150‰鹽度范圍內(nèi)始終維持在78%以上的酶活。此外在有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、異丙醇、二甲基亞砜(DMSO)中該酶具有較好的耐受性和穩(wěn)定性,四種溶劑中對(duì)酶反應(yīng)抑制最強(qiáng)的是異丙醇,在濃度為10%和40%的異丙醇緩沖液中,剩余酶活分別為82%和29%；而甲醇在不同濃度下表現(xiàn)出

6、抑制或促進(jìn)酶反應(yīng)的現(xiàn)象,在10%和20%的甲醇溶劑中,殘余酶活分別為139%和127%,促進(jìn)酶反應(yīng)進(jìn)行,而在30%和40%的甲醇溶劑中,酶活分別為65%和33%,抑制酶反應(yīng)進(jìn)行；酶在低濃度的乙醇溶液中抑制作用不明顯,在10%和20%的乙醇溶液中,酶活分別為89%和86%,而在高濃度時(shí)酶反應(yīng)受到很大抑制,在40%的乙醇溶劑中,酶活降為29%。通過(guò)PCR技術(shù)從短小芽孢桿菌B106 (Bacillus pumilus)中擴(kuò)增出脂肪酶基因全長(zhǎng)。

7、開(kāi)放讀碼框?yàn)?48bp,編碼215aa。最相似菌為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus (AAR84668),相似度達(dá)到98%。氨基酸一級(jí)序列組成中極性氨基酸占53.02%,疏水氨基酸占46.98%。同時(shí)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),α螺旋占25.58%,β折疊占23.72%。從細(xì)菌的PROSITE motif分析,得出短小芽孢桿菌B106脂肪酶中含有四種潛在的Pattern：cAMP/cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(1個(gè)),蛋白酶