ATF3通過AP-1調控香煙煙霧誘導的氣道粘液高分泌.pdf

1、背景:眾所周知，粘液的過表達是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)的重要病理特征。研究表明，香煙煙霧(cigarette smoke，CS)暴露與COPD的發(fā)生發(fā)展關系密切。氣道粘液的過度分泌可引起氣道阻塞，從而導致肺功能下降。轉錄激活因子3(Activating transcription factor3，ATF3)是一種參與細胞反應過程的適應性反應基因。研究顯示其對炎

2、癥反應具有雙向調節(jié)作用，通過調節(jié)不同的靶基因從而加強或抑制炎癥反應，機體會根據應激條件的性質（如應激的類型和持續(xù)的時間）和應激信號影響靶組織/細胞類型的不同而發(fā)生不同的反應。據報道，氣道粘液的過表達也是氣道炎癥反應的一種表現形式。然而，迄今為止國內外尚未有研究探討氣道上皮細胞中ATF3的表達在調控香煙煙霧誘導的氣道粘液分泌中的作用。
　　目的:本課題擬探討ATF3是否參與調控COPD中MUC5AC（氣道粘液的一種重要組成成分）的表

3、達，并探索其機制。
　　方法:檢測香煙煙霧暴露對人體氣道上皮細胞HBE（正常氣道上皮細胞系），NCI-H292細胞（人肺粘液表皮樣癌來源細胞系）和MTEC(小鼠原代氣道上皮細胞)的ATF3和MUC5AC的表達影響。利用ATF3小干擾RNA(ATF3 small-interferingRNA，ATF3 siRNA)和ATF3過表達質粒探討ATF3是否與香煙煙霧誘導的MUC5AC的表達有關。利用實時定量PCR(quantitative

4、 real-time polymerase chainreaction，Q-PCR)，蛋白質印跡法(Western Blot，WB)和免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測ATF3的缺失或過表達是否影響香煙煙霧誘導的MUC5AC的表達。進一步利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)及染色體免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation，CHIP)法驗證假設，即A

5、TF3是否通過激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)間接結合到MUC5AC啟動子區(qū)域從而調控其表達。在體內研究中，我們用通過CSE氣道滴注和熏煙制造ATF3基因敲除小鼠(ATF3-/-mice)的COPD模型，從而驗證ATF3是否參與調控香煙煙霧誘導的氣道粘液的表達。
　　結果:
　　1.體外實驗中，香煙煙霧能顯著地誘導氣道上皮細胞HBE，NCI-H292和MTEC中ATF3和MUC5AC的表達。當用

6、ATF3 siRNA特異性地敲除ATF3這個基因后，香煙煙霧誘導的MUC5AC的表達顯著下降，而白介素-6(interleukin-6，IL-6)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)的表達明顯增高。然而，ATF3過表達質粒未對香煙煙霧誘導的MUC5AC的表達產生明顯影響。這一現象提示，ATF3可能并非直接調控MUC5AC的表達。Co-IP和CHIP實驗結果證實ATF3通過AP-1信號通路作用于MUC5AC的啟動子區(qū)域，從

7、而間接調控香煙煙霧誘導的氣道MUC5AC的表達。
　　2.體內實驗中，CSE氣道滴注野生型小鼠(Wild Type mice，WT mice)大氣道MUC5AC的表達較對照組明顯升高，然而在ATF3-/-小鼠中氣道MUC5AC的表達并未明顯下降。這和體內的結果并不一致。然而，在ATF3-/-小鼠模型組中，氣管及血管周圍中性粒細胞的浸潤明顯增加。（體內模型需進一步參照熏煙小鼠的結果）。
　　結論:本研究結果提示ATF3通過AP