基于液質聯(lián)用技術的大薊藥代動力學特征及其3種黃酮類成分的體外代謝研究.pdf

1、大薊為菊科植物Cirsium japonicum DC.的干燥地上部分或根，為多年生草本植物，全國大部分地區(qū)均有分布。收載于2010版中國藥典，有涼血止血，散瘀解毒消癰的功效。用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏，外傷出血，癰腫瘡毒，是一味用藥歷史悠久的傳統(tǒng)中藥。研究表明大薊的化學成分復雜，主要含黃酮類、長鏈炔醇類、揮發(fā)油類、三萜和甾體類化合物等。此外，大薊的藥理作用和臨床應用廣泛，研究認為黃酮類化合物是其主要的活性成分。然而，迄今為止有關

2、中藥大薊的藥代動力學研究還未見報道，其主要成分的代謝情況尚不清楚，因此，本文對大薊主要黃酮類成分的吸收、分布、排泄以及體外代謝進行研究。建立大鼠口服大薊提取物后血漿中7種黃酮類成分柳穿魚葉苷、蒙花苷、柳穿魚黃素、高車前素、香葉木素、刺槐素和芹菜素的HPLC-MS/MS檢測方法，闡明相關藥動學參數;建立大鼠口服大薊提取物后柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素3種主要黃酮類成分在尿液、膽汁、糞便和各組織中的HPLC-MS/MS檢測方法，研究其排泄

3、規(guī)律和組織分布特征;采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術對3種主要黃酮類成分柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素的體外代謝進行研究。
　　第一部分液質聯(lián)用法同時測定大鼠血漿中7種黃酮類成分及其藥代動力學研究
　　目的:建立7種黃酮類成分柳穿魚葉苷、蒙花苷、柳穿魚黃素、高車前素、香葉木素、刺槐素和芹菜素在大鼠血漿中的HPLC-MS/MS檢測方法，進行藥動學研究。
　　方法:色譜條件:反相Diamonsil C18柱(15

4、0 mm×4.6 mm，5μm)，A（甲醇），B（0.1％甲酸-水）為流動相進行梯度洗脫，洗脫程序為0.0-1.5min35％-65％ A,1.5-6 min65％ A,6-8 min95％A，流速為0.8 mL/min。質譜條件:電噴霧離子源（ESI源），源溫度設為650℃。采用多反應監(jiān)測模式(MRM)進行正負離子同時監(jiān)測掃描。12只SD大鼠隨機分為兩組，給藥后A組于0，2，5，10，15，25，60，90，120，180 min，B

5、組于0，5，10，25，60，90，180，360，720，1140，1800 min眼內眥取血于肝素化離心管內，制備血漿，以磺胺甲噁唑為內標，樣品處理采用甲醇沉蛋白法。
　　結果:7種被測物質的線性關系良好（R2≧0.9954），大鼠給藥后，柳穿魚葉苷、蒙花苷、柳穿魚黃素、高車前素、香葉木素和刺槐素的血藥濃度于5 min達峰，Cmax分別為876.77±97.34 ng/mL，86.79±1.70 ng/mL，6.13±0.12

6、 ng/mL,32.85±2.50 ng/mL,37.2±2.04 ng/mL和19.02±1.29ng/mL，且在180 min基本消除完全;芹菜素在360 min達峰，Cmax為148.26±20.63 ng/mL。芹菜素產生雙峰現象，推測與肝腸循環(huán)有關。
　　結論:本研究首次建立了一種靈敏的HPLC-MS/MS方法，同時測定了大鼠口服大薊提取物后血漿中7種黃酮類成分的含量，并成功應用于藥代動力學研究。結果表明，除芹菜素外，6

7、種大薊黃酮類成分在大鼠體內吸收和消除迅速。
　　第二部分液質聯(lián)用法同時測定大鼠尿液、膽汁和糞便中3種黃酮類成分及其排泄研究
　　目的:建立大鼠口服大薊提取物后，尿液、膽汁和糞便中3種黃酮類成分柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素含量的HPLC-MS/MS測定方法，并研究排泄規(guī)律。
　　方法:色譜條件:反相Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱流動相為A（甲醇）-B（0.1％甲酸），梯度洗脫，洗脫程

8、序如下:0.0-1.5min，35-90％A;1.5-4.5min,90-95％A;4.5-6.5min,95％A;6.6min,35％A。流速為0.8 mL/min。質譜條件:電噴霧離子源(ESI源)，源溫度設為650℃。采用多反應監(jiān)測模式(MRM)進行正離子監(jiān)測。大鼠按5mL/kg灌胃給予大薊提取物后，分別收集0-4，4-8，8-12，12-24，24-36，36-48 h時間段的尿液和糞便樣品，膽管插管術后收集0-2，2-4，4-

9、6，6-8，8-12，12-24，24-36 h時間段的膽汁樣品，樣品處理后分別測定。
　　結果:柳穿魚葉苷在24 h內經尿液、膽汁和糞便基本排泄完全，分別占總排泄量的94.52％、95.27％和99.14％，占給藥量的0.07％、0.99％和14.96％。蒙花苷在24 h內經尿液、膽汁和糞便基本排泄完全，分別占總排泄量的97.53％、95.13％和99.66％，占給藥量的0.047％，0.36％，10.50％。柳穿魚黃素在36

10、h內經尿液和糞便基本排泄完全，分別占總排泄量的98.17％和99.98％，占給藥量的2.21％和25.85％。柳穿魚黃素在膽汁樣品中未檢測到。
　　結論:本試驗首次對大鼠口服大薊提取物后，尿液、膽汁和糞便中的3種黃酮類成分的含量進行了測定，方法準確、可靠。3種黃酮類成分的主要排泄途徑為經糞便排泄，柳穿魚黃素不經膽汁排泄。
　　第三部分大鼠口服大薊提取物后柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素3種黃酮類成分的組織分布研究
　　目

11、的:建立大鼠口服大薊提取物后心、肝、脾、肺、腎和腦中柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素含量的HPLC-MS/MS測定方法，并研究其組織分布特征。
　　方法:色譜條件:反相Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm，5μm），流動相為A（甲醇）-B（0.1％甲酸），梯度洗脫，洗脫程序如下:0.0-1.5min，35％-90％A;1.5-4.5min,90％-95％A;4.5-6.5min,95％A;6.6min,35％A。流速

12、為0.8 mL/min。質譜條件:電噴霧離子源(ESI源)，源溫度設為650℃。采用多反應監(jiān)測模式(MRM)進行正離子監(jiān)測。20只雄性SD大鼠，隨機分為4組，按5 mL/kg灌胃給予大薊提取物，依次于5 min，10 min，25 min，45 min處死，取出各組織，處理后測定各組織中柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素的含量。
　　結果:柳穿魚葉苷和蒙花苷在脾臟中含量最高，分別為960.76±130.72ng/g和350.76±62

13、.44 ng/g，柳穿魚黃素在腎臟中含量最高，為581.94±82.70ng/g，3種成分在各組織中均可檢測到，在給藥45 min后，含量顯著下降。結論:本實驗首次建立了一種HPLC-MS/MS方法對大鼠口服大薊提取物后，各組織中柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素的含量進行了測定。結果表明3種黃酮類成分在血流豐富的器官含量較高，可通過血腦屏障，且在各組織中消除迅速，無長期蓄積現象。
　　第四部分大薊中3種黃酮類成分柳穿魚葉苷、蒙花苷和

14、柳穿魚黃素的體外代謝研究
　　目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS法，考察柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素在大鼠肝微粒體中的Ⅰ相和Ⅱ相體外代謝情況。
　　方法:建立Ⅰ相孵育體系，由0.1 mol/L K2HPO4緩沖液(pH7.4)組成，其中含β-NADP1.3 mmol/L，G-6-P3.3 mmol/L，G-6-PD1.0 U/mL，MgC123.3 mmol/L，肝微粒體蛋白1 mg/mL;建立Ⅱ相孵育體系，由肝

15、微粒體蛋白1 mg/mL，UDPGA2 mmol/L，MgC128 mmol/L，丙甲菌素25μg/mL，50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液組成。分別向孵育體系中加入待測物，啟動反應，孵育結束后，應用UHPLC-Q-TOF-MS/MS在IDA模式下對處理后的樣品進行檢測，并結合軟件peakview1.2和Metabolitepilot1.5對結果進行分析。
　　結果:柳穿魚葉苷和蒙花苷各自檢測到1個Ⅰ相代