基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的中藥三種單體成分體外代謝研究.pdf

1、藥物在體內(nèi)經(jīng)吸收、分布之后，可經(jīng)藥物代謝酶催化生成代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生藥理或毒理作用，研究藥物代謝對明確其代謝途徑和代謝機制具有重要的指導(dǎo)意義。肝臟是參與藥物代謝的重要器官，富含藥物代謝酶，是藥物發(fā)生I相和II相代謝反應(yīng)的主要場所。肝微粒體是肝內(nèi)代謝酶的主要來源，包含催化I相代謝的CYP450酶和II相代謝的UGTs等酶類。其代謝模型操作簡單、價格合理、儲存方便，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于體外藥物代謝的研究中。
　　近年來，隨著中藥現(xiàn)代化研究及藥物

2、分析技術(shù)的發(fā)展，對中藥單體成分特別是對中藥有效成分的代謝研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點。本研究選取中藥白芷主要成分香豆素類化合物蛇床夫內(nèi)酯及中藥芫花主要成分黃酮類化合物羥基芫花素和芫花素，利用高分辨質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，采用人肝微粒體溫孵、重組酶溫孵及化學(xué)抑制劑試驗等方法，對三個單體成分在人肝微粒體中的代謝進(jìn)行研究并對代謝表型進(jìn)行鑒別，推測可能的代謝途徑并進(jìn)行比較，為進(jìn)一步理解其代謝機制提供依據(jù)和技術(shù)支持。
　　第一部分：蛇床夫內(nèi)酯、羥

3、基芫花素和芫花素在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物鑒定
　　目的：本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，建立蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素的人肝微粒體體外溫孵模型，對其在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定，并歸納總結(jié)其代謝途徑，為進(jìn)一步闡明其體內(nèi)過程提供理論依據(jù)。
　　方法：通過向含有人肝微粒體的溫孵體系中加入NADPH和UDPGA作為反應(yīng)啟動因子，建立I相代謝、葡萄糖醛酸化代謝及級聯(lián)代謝反應(yīng)的溫孵模型。建立UHPL

4、C-Q-TOF-MS/MS方法對蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體溫孵樣品中的各類代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，將采集到的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)借助Peakview1.2和MetabolitePilot1.5數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，總結(jié)三個化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，推測代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)并推斷其代謝途徑。
　　結(jié)果：采用蛇床夫內(nèi)酯對照品對溫孵樣品內(nèi)的原型藥物進(jìn)行確證，正離子模式下，蛇床夫內(nèi)酯主要脫去異戊烯基形成m/z233的特征碎片離子，而后連續(xù)丟失CO

5、，符合香豆素類化合物的一般裂解規(guī)律。通過與空白組和對照組溫孵樣品比較，在溫孵樣品中共鑒定出24個蛇床夫內(nèi)酯的I相代謝產(chǎn)物，分別為蛇床夫內(nèi)酯經(jīng)氧化、與水加成、羧基化和脫氫作用生成。其中加氧后的羥基化代謝物 M1、M2和環(huán)氧化代謝物 M3為蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體中最主要的代謝產(chǎn)物。但是未檢測到蛇床夫內(nèi)酯及其I相代謝物的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，可能與其結(jié)構(gòu)中不含易與葡萄糖醛酸發(fā)生II相結(jié)合反應(yīng)的活潑H有關(guān)。
　　采用羥基芫花素和芫花素對照

6、品對溫孵樣品內(nèi)的原型藥物進(jìn)行確證，負(fù)離子模式下，羥基芫花素和芫花素主要發(fā)生黃酮類化合物特征性的RDA裂解。通過與空白組和對照組溫孵樣品比較，在羥基芫花素溫孵樣品中共發(fā)現(xiàn)10個代謝產(chǎn)物，其中包括3個I相代謝產(chǎn)物、3個葡萄糖醛化產(chǎn)物和4個級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物。在芫花素溫孵樣品中共發(fā)現(xiàn)19個代謝產(chǎn)物，其中包括7個I相代謝物、2個葡萄糖醛酸化代謝物和10個級聯(lián)反應(yīng)代謝物。兩化合物經(jīng)去甲基和氧化引入羥基，而后與葡萄糖醛酸結(jié)合，II相代謝為其主要代謝反應(yīng)類

7、型。
　　結(jié)論：三種單體成分均發(fā)生I相代謝反應(yīng)，引入羥基等極性基團(tuán)，代謝產(chǎn)物極性增大，黃酮類成分羥基芫花素和芫花素更能與葡萄糖醛酸結(jié)合發(fā)生 II相代謝反應(yīng)，葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物極性進(jìn)一步增加，更易于排出體外。
　　第二部分：蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素在人源CYP450酶中的代謝表型鑒定
　　目的：本試驗應(yīng)用HPLC-Q-TRAP-MS/MS和UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，分別采用肝微粒體結(jié)合選擇性化學(xué)抑制

8、劑和cDNA重組酶孵育法，對參與蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中代謝的CYP450酶表型進(jìn)行鑒定，為闡明其代謝機制和臨床安全合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：將蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素與CYP450酶各亞型的選擇性化學(xué)抑制劑在人肝微粒體中共同孵育，對三個單體成分反應(yīng)后的剩余量進(jìn)行測定，然后與不加入化學(xué)抑制劑的陰性對照溶液比較，考察化學(xué)抑制劑對三個單體成分代謝轉(zhuǎn)化率的影響。
　　建立蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫

9、花素與CYP450各亞型重組酶的溫孵體系，測定CYP450重組酶溫孵樣品中三個單體成分反應(yīng)后的剩余量，與加入滅活肝微粒體的對照組相比，應(yīng)用底物消除法評價CYP450酶對藥物清除的貢獻(xiàn)。
　　結(jié)果：蛇床夫內(nèi)酯化學(xué)抑制劑試驗結(jié)果顯示，其代謝轉(zhuǎn)化率隨著CYP1A2和 CYP3A4的選擇性抑制劑α-萘黃酮和酮康唑濃度的增加有較為顯著的下降。與CYP450重組酶的溫孵反應(yīng)中，隨著反應(yīng)時間的增加，重組酶CYP1A2和CYP3A4溫孵體系中蛇床

10、夫內(nèi)酯的消較為明顯，而其他亞型組含量變化較小。CYP1A2和CYP3A4能夠催化蛇床夫內(nèi)酯生成其主要單氧化代謝產(chǎn)物M1、M2和M3。
　　羥基芫花素和芫花素的代謝轉(zhuǎn)化率均隨 CYP1A2、CYP2C9和CYP2C19的選擇性抑制劑α-萘黃酮、磺胺苯吡唑和鹽酸噻氯匹定濃度的增加有明顯下降，以CYP2C9最為顯著。與CYP450重組酶的溫孵反應(yīng)中，隨著反應(yīng)時間的增加，重組酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4可催化

11、羥基芫花素和芫花素代謝消除。CYP1A2和CYP3A4可同時催化去甲基和單氧化反應(yīng)， CYP1A2的催化活性高于CYP3A4。CYP2C9和CYP2C19主要介導(dǎo)羥基芫花素的去甲基化代謝，以CYP2C9的催化活性最高。
　　結(jié)論：蛇床夫內(nèi)酯、羥基芫花素和芫花素均可經(jīng)CYP1A2和CYP3A4催化生成主要的氧化代謝產(chǎn)物，CYP2C9和CYP2C19在催化羥基芫花素和芫花素去甲基化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，代謝表型的鑒定也為進(jìn)一步研究藥物在

12、生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化及預(yù)測藥物相互作用提供了理論依據(jù)。
　　第三部分：羥基芫花素和芫花素在人源UGT酶中的代謝表型鑒定
　　目的：應(yīng)用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，采用人肝微粒體 UGT重組酶孵育法，對參與羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中代謝的UGT酶表型進(jìn)行鑒定，為闡明其代謝機制和臨床安全合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：建立羥基芫花素和芫花素與 UGT重組酶的溫孵體系，通過UHPLC-Q-TOF-MS/M

13、S方法測定溫孵樣品中葡萄糖醛酸化代謝物的生成量，并比較葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物在各UGT亞型酶中的生成情況。
　　結(jié)果：試驗結(jié)果表明，UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7可參與羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中的葡萄糖醛酸化代謝；UGT1A1和UGT1A9可介導(dǎo)兩個黃酮類化合物A環(huán)5-羥基和B環(huán)3'-和4'-羥基葡萄糖醛酸化，且催化活性較高；而 UGT1A3、UGT1A10和UGT2B7只介導(dǎo)B環(huán)羥基參

14、與反應(yīng)，且以UGT1A10催化活性最高。
　　結(jié)論：羥基芫花素和芫花素的葡萄糖醛酸化代謝可經(jīng) UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7介導(dǎo)，推測UGT1A1、UGT1A9和 UGT1A10為參與羥基芫花素和芫花素葡萄糖醛酸化代謝的主要 UGT酶。
　　第四部分：蛇床夫內(nèi)酯對人肝CYP450酶的抑制作用
　　目的：采用探針底物法，根據(jù)FDA指導(dǎo)原則選擇細(xì)胞色素P450酶亞型特異性探針底物，研

15、究蛇床夫內(nèi)酯對人肝 CYP1A、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4這7種CYP450酶亞型的影響。
　　方法：應(yīng)用體外肝微粒體溫孵體系，建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法，測定各亞型特異性探針底物生成代謝產(chǎn)物的含量，采用 GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行非線性擬合并計算 IC50值，從而評價蛇床夫內(nèi)酯對CYP450酶7個亞型的體外潛在抑制作用。
　　結(jié)果：蛇床夫內(nèi)酯與CYP450酶各亞型探針底

16、物共同孵育結(jié)果顯示，蛇床夫內(nèi)酯可對CYP3A4產(chǎn)生中等強度抑制作用，IC50=6.61μmol·L-1；對CYP2C9和 CYP2C19產(chǎn)生弱抑制作用，IC50值分別為20.09和17.49μmol·L-1；對于CYP1A、2B6、2C8和2D6基本不存在抑制作用，IC50均大于100μmol·L-1。
　　結(jié)論：蛇床夫內(nèi)酯可對CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4產(chǎn)生抑制作用，與經(jīng)這3個CYP450亞型酶代謝的藥物合用時可能

17、因其對酶的抑制作用造成藥物蓄積，使血藥濃度升高，因此需要在聯(lián)合用藥時多加注意。
　　第五部分：蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體中的酶促反應(yīng)動力學(xué)研究
　　目的：研究蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體中的酶促反應(yīng)動力學(xué)，優(yōu)化溫孵試驗反應(yīng)條件，并計算其酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。
　　方法：考察溫孵時間、蛋白濃度和底物濃度對溫孵體系的影響。以磺胺甲噁唑為內(nèi)標(biāo)，Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），甲醇和1 mmol·L

18、-1乙酸銨水溶液為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧離子源（ESI源），正離子模式下 MRM監(jiān)測，測定人肝微粒體溫孵樣品中蛇床夫內(nèi)酯的含量。采用 Linewrave-Burk作圖法處理數(shù)據(jù)，計算酶促動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。
　　結(jié)果：蛇床夫內(nèi)酯在人肝微粒體體系中最佳溫孵時間為60 min，蛋白濃度為1 mg·mL-1，底物濃度為30μmol·L-1。Km=48.75μmol·L-1， Vmax=0.5068μmol·(min·mg p