γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：
　　γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferoninducible protein10，IP-10)是CXC類趨化因子，其受體為CXCR3。IP-10在單核巨噬細(xì)胞、活化的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)。IP-10具有多種生物學(xué)功能。例如，活化的IP-10可趨化炎癥細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子;可以誘導(dǎo)初始的CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，Th1細(xì)胞可分泌白介素2和IFN-γ，而IFN-γ又可以促進(jìn)多種細(xì)

2、胞產(chǎn)生IP-10，產(chǎn)生的IP-10通過正反饋作用招募更多的Th1細(xì)胞聚集到炎癥部位，最終加強Th1型炎癥反應(yīng)等等，表明IP-10與Th1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。并且可通過這種炎癥反應(yīng)加強其免疫效應(yīng)，從而實現(xiàn)抗感染免疫效應(yīng)。因此，IP-10被認(rèn)為具有增強免疫效應(yīng)的免疫佐劑潛能。
　　肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP/PJP），是一種由肺孢子菌(pneumocystis)引起的間質(zhì)性漿細(xì)胞性肺炎。PC

3、P好發(fā)于CD4+T細(xì)胞數(shù)量及功能低下的人群，因此CD4+T細(xì)胞的缺乏給預(yù)防PCP疫苗免疫效果形成了難以突破的瓶頸。Beck等發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞對于大鼠源肺孢子菌(卡氏肺孢子菌，Pneumocystiscarinii)清除起重要作用，其清除的機制包括CD4+T細(xì)胞通過輔助細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答發(fā)揮作用和CD8+T細(xì)胞的直接殺傷作用。McAllister等研究證明CD8+T細(xì)胞清除肺孢子菌的主要機制是該類細(xì)胞可以較好地表達(dá)CXCR3。隨后作者提出疑問

4、:機體抵御肺孢子菌感染的過程是否必須有CXCR3介導(dǎo)的信號通路的參與？實驗結(jié)果表明，CXCR3缺陷但CD4+T細(xì)胞水平正常的小鼠，其清除肺孢子菌的能力并未減弱，這說明CXCR3在CD4+T細(xì)胞抗肺孢子菌感染過程中并不是必需的分子。而在肺組織內(nèi)過表達(dá)IP-10且缺少CD4+T細(xì)胞的小鼠則可加速機體清除肺孢子菌的速率，說明即使機體缺失CD4+T細(xì)胞，IP-10也可直接趨化CD8+T細(xì)胞到肺部感染區(qū)域，發(fā)揮清除肺孢子菌的作用，認(rèn)為IP-10在

5、抗感染及治療自身免疫性疾病等方面具有潛在的應(yīng)用前景。
　　以上這些研究結(jié)果為預(yù)防PCP疫苗的研究提供新思路和新希望。本文擬構(gòu)建一個IP-10基因的重組腺病毒載體，期望為PCP疫苗研究構(gòu)建一個加強免疫效應(yīng)的免疫佐劑，以推進(jìn)防治PCP疫苗的研究進(jìn)展。
　　方法：
　　1、大鼠IP-10基因片段的獲取與命名
　　(1)大鼠IP-10基因的來源
　　從GenBank中搜索獲取大鼠IP-10基因序列（GenBank號

6、BC058444.1），由上海生工生物公司合成并測序驗證，命名pUC-IP10。
　　(2) IP-10基因擴(kuò)增與純化
　　設(shè)計一對引物（引物含起始密碼子、終止密碼子、酶切位點、保護(hù)堿基），以質(zhì)粒pUC-IP10為模板，用PCR方法擴(kuò)增IP-10基因，并回收。
　　2、pAd-IP-10重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　(1) IP-10基因片段的T載體克隆及鑒定
　　將回收的IP-10基因片段插入到pMD18

7、-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，挑單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，進(jìn)而，小試管擴(kuò)大培養(yǎng)單菌落，質(zhì)粒小提，利用限制性內(nèi)切酶BglⅡ及XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，并將剩余質(zhì)粒送至華大基因公司測序，經(jīng)測序正確的質(zhì)粒命名為T-IP10。
　　(2) IP-10基因與pAdTrack-CMV穿梭載體的構(gòu)建及鑒定
　　分別對質(zhì)粒T-IP10和腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后分別回收所需的的目的片段IP-10及開

8、環(huán)的pAdTrack-CMV載體。將載體與目的基因通過T4DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化DH5α中，涂布于含卡那霉素（100tg/ml）的瓊脂平板，挑取單個菌落進(jìn)行PCR及酶切鑒定。將PCR及酶切鑒定均正確的質(zhì)粒命名為pAdTr-IP10。
　　(3) pAd-IP-10重組腺病毒載體的構(gòu)建
　　利用PmeⅠ酶將pAdTr-IP10線性化，去磷酸化，并純化后，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入含骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的Bj5183感受態(tài)中，進(jìn)

9、行細(xì)菌內(nèi)同源重組，涂布于含卡那霉素（100μg/ml）的瓊脂平板上，挑選較小的單菌落進(jìn)行PCR及酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pAd-IP10。
　　3、pAd-IP-10重組腺病毒載體的包裝
　　將質(zhì)粒pAd-IP10用PacⅠ酶切線性化并純化后，通過Attractene TransfectionReagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24-48h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，觀察

10、細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)情況。轉(zhuǎn)染8～10 d后將細(xì)胞刮下，將細(xì)胞收集在凍存管中，于-80℃和37℃反復(fù)凍融5次，12000rpm離心5 min，收集的上清液即為病毒原液。
　　4、pAd-IP-10重組腺病毒的驗證
　　取24孔板培養(yǎng)的呈對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞，棄上清。將重組腺病毒的病毒液原液加入孔中，0.5 ml/孔，輕輕晃動，37℃孵育2h后補加完全培養(yǎng)液0.5 ml/孔，3d后檢查

11、細(xì)胞是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)及綠色熒光，驗證重組腺病毒的產(chǎn)生，并收集細(xì)胞及上清，利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)引物IP-10F及IP-10R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠IP-10基因獲取與鑒定
　　合成并驗證了攜帶大鼠IP-10基因pUC-IP10。用PCR方法擴(kuò)增出IP-10基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，獲得大小約為300bp的產(chǎn)物條帶，與

12、預(yù)期結(jié)果(297bp)一致。
　　2、pAd-IP-10重組腺病毒表達(dá)載體的鑒定
　　(1) IP-10基因片段的T載體克隆及鑒定
　　回收的目的基因片段IP-10，與Pmd18-T載體連接，轉(zhuǎn)化后經(jīng)PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析，在約300bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期相符，并將其送至華大基因測序，利用NCBI的BLAST將測序結(jié)果與IP-10基因序列比對，一致性為100％。
　　(2) pAdTr-IP10重組

13、腺病毒穿梭載體的鑒定
　　將重組的pAdTr-IP10質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定正確后，利用限制性內(nèi)切酶BglⅡ及XhoⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳，獲得兩條帶，在300bp處的條帶為目的基因。
　　(3)重組腺病毒載體的鑒定
　　重組腺病毒載體pAd-IP10經(jīng)PacⅠ酶切后電泳，可觀察到1條大的DNA片段（約31kb）和1條較小的DNA片段(4.5 kb)，確定重組腺病毒載體構(gòu)建成功。
　　3、pAd-IP10的包裝<

14、br>　　根據(jù)Attractene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染說明書將質(zhì)粒pAd-IP10轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24-48h后，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白GFP表達(dá)，出現(xiàn)細(xì)胞病變(Cytopathiceffect，CPE)情況。
　　4、重組腺病毒的驗證
　　將病毒初液再次感染HEK293細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)熒光，說明重組的腺病毒具有感染性。并且利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電

15、泳結(jié)果顯示pAd-IP10重組腺病毒感染的293細(xì)胞，PCR檢測顯示有1條約300 bp條帶，而pAd-Track感染的293細(xì)胞，及正常細(xì)胞均無此特異條帶，則表明該條帶系pAd-IP10重組腺病毒感染293細(xì)胞后產(chǎn)生的IP-10，重組腺病毒pAd-IP10在293細(xì)胞中能有效轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10基因的重組腺病毒載體。
　　2、重組腺病毒載體pAd-IP10在HEK293細(xì)胞中包