人LMP-1基因腺病毒重組表達載體的構(gòu)建及功能鑒定.pdf

1、背景:LIM礦化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)作為一個新的可能參與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMPs)信號通路的胞內(nèi)誘導成骨性因子,其具體生物學機制尚不明了。
　　 目的:應用Adeasy-1腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建含人LIM礦化蛋白-1(LIMmineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重組表達載體,并感染犬骨髓間

2、充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),檢測LMP-1基因在體外的表達及研究其誘導成骨機制。
　　 方法:擴增、制備pAdTrack-CMV和pUC57-LMP-I,經(jīng)Kpn I、HindⅢ雙酶切,酶切產(chǎn)物連接形成pAdTrack-CMV-LMP-1,經(jīng)PmeI線性化后在BJ5183內(nèi)與pAdeasy-1同源重組,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-LMP-1。經(jīng)人胚胎腎293細胞(

3、HEK293)包裝、擴增后得到復制缺陷重組腺病毒Ad-LMP-1,擴增純化后測定滴度,以最佳MOI值體外感染犬BMSCs,行RT-PCR及Western Blot檢測LMP-1、犬BMP-7基因的表達。重組Ad-LMP-1和(或)外源性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(rhBMP-7)處理犬BMSCs,21d后行礦化(鈣)結(jié)節(jié)茜素紅染色研究LMP-1基因的誘導成骨機制。
　　 結(jié)果:①經(jīng)鑒定Ad-LMP-1構(gòu)建成功,在HEK293中包裝

4、擴增后滴度約2.2x109efu/ml。②以MOI值100感染犬BMSCs可以獲得最佳感染效率,感染后的犬BMSCs能在基因和蛋白水平上表達LMP-1,但是并未引起犬BMP-7基因的表達。③犬BMSCs經(jīng)Ad-LMP-1和(或)rhBMP-7處理后21d,Ad-LMP-1或rhBMP-7均不能單獨促使BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化,Ad-LMP-1與外源性的rhBMP-7表現(xiàn)為協(xié)同效應,共同促使BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化。
　　 結(jié)論: