人端粒酶催化亞單位hTERT基因重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種以進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙、老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)及基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失和突觸丟失為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD是老年性癡呆的主要原因之一，占總病因50％以上，嚴(yán)重影響老年人口的生存質(zhì)量。AD的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前認(rèn)為神經(jīng)元的老化以及多種原因引起的神經(jīng)元凋亡是其主要發(fā)病原因之一。因此，延緩腦神經(jīng)元的老化、阻止神經(jīng)元凋亡可能成為AD的有效防治策略。 端粒酶(Te

2、lomerase)因其與被譽(yù)為控制人類細(xì)胞衰老的有絲分裂鐘——端粒(Telomere)的特殊關(guān)系，一直是衰老相關(guān)疾病以及腫瘤防治研究的熱點(diǎn)。hTERT(humantelomerasereversetranscriptase)為人端粒酶催化亞基，是端粒酶發(fā)揮功能的必需組分。人體內(nèi)有旺盛增殖能力的生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等可檢測(cè)到端粒酶活性，而多數(shù)增殖能力有限的體細(xì)胞不表達(dá)或僅低表達(dá)端粒酶活性。許多研究發(fā)現(xiàn)hTERT基因轉(zhuǎn)染重建(激活)端粒酶活

3、性可延緩細(xì)胞衰老甚至使細(xì)胞永生。雖85％以上的癌細(xì)胞具有很高的端粒酶活性，但端粒酶基因不是致癌基因，端粒酶的激活不是癌變的前提和必要條件。近來(lái)研究顯示端粒酶和hTERT與神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和凋亡有著密切的關(guān)系。 為了進(jìn)一步闡明端粒酶和hTERT的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選擇pADEasy-1腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建hTERT基因重組腺病毒。腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，宿主范圍廣，生物安全性較好，在包裝細(xì)胞內(nèi)易擴(kuò)增得到高滴度病毒，而且既可

4、感染增殖細(xì)胞又可感染非增殖細(xì)胞。構(gòu)建hTERT基因重組腺病毒并鑒定其對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的感染力以及基因轉(zhuǎn)移效果，可為后續(xù)的研究創(chuàng)造條件，為探索以端粒酶為靶點(diǎn)的AD基因治療新途徑奠定基礎(chǔ)。本研究包括以下兩個(gè)主要內(nèi)容： 第一章hTERT重組腺病毒骨架載體(pAD-hTERT)的構(gòu)建 目的構(gòu)建hTERT重組腺病毒骨架載體(pAD-hTERT) 方法以質(zhì)粒pCI-neo-hTERT為模板，設(shè)計(jì)引物，兩端引入酶切位點(diǎn)，PCR

5、法獲取目的基因；將目的基因定向克隆到pADTrack-CMV穿梭質(zhì)粒得到重組穿梭質(zhì)粒pADTrack-hTERT并酶切及測(cè)序鑒定；Pme-1線性化的重組穿梭質(zhì)粒和空穿梭質(zhì)粒分別與腺病毒骨架pADEasy-1在BJ5183菌進(jìn)行同源重組，得到hTERT重組腺病毒骨架質(zhì)粒pAD-hTERT和對(duì)照GFP腺病毒骨架質(zhì)粒pAD-GFP，酶切鑒定。將鑒定正確的pAD-hTERT和pAD-GFP轉(zhuǎn)化DH5α凍存?zhèn)溆谩?結(jié)果酶切及測(cè)序分析重組穿

6、梭質(zhì)粒構(gòu)建正確，目的基因未突變；酶切分析證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒和空穿梭質(zhì)粒與pADEasy-1正確同源重組，hTERT重組腺病毒骨架質(zhì)粒帶有目的基因。 第二章hTERT重組腺病毒(AD-hTERT)的包裝、擴(kuò)增與鑒定 目的包裝、鑒定hTERT重組腺病毒，并擴(kuò)增獲得高滴度腺病毒。 方法PacⅠ酶切線性化pAD-hTERT和pAD-GFP腺病毒骨架質(zhì)粒，純化滅菌；利用FuGENE6TransfectionReagent將兩

7、種病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，收集病毒上清，PCR法鑒定目的基因；病毒上清重復(fù)感染HEK293獲得高滴度重組腺病毒；測(cè)定重組腺病毒感染復(fù)數(shù)(MultiplicityofInfection，MOI)；感染人胚胎海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)元；RT-PCR法分析目的基因的表達(dá)。 結(jié)果PCR結(jié)果說(shuō)明重組腺病毒攜帶目的基因；報(bào)告基因GFP的表達(dá)顯示重組腺病毒具有感染活力；RT-PCR結(jié)果顯示重組腺病