鋅指蛋白ZBTB20的重組腺病毒載體的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控對(duì)基因的表達(dá)至關(guān)重要，甚至對(duì)機(jī)體的發(fā)育也起到極大的作用?；虮磉_(dá)的調(diào)控過(guò)程主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)其特定的結(jié)構(gòu)域與染色體或其他蛋白質(zhì)相結(jié)合，起到對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)或阻礙作用。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、增強(qiáng)植物抗逆性等方面具有重要的作用。鋅指蛋白ZBTB20由741個(gè)編碼氨基酸組成，N端含有POZ結(jié)構(gòu)域（通常介導(dǎo)蛋白間的相互作用），C端含有5個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)

2、域（通常介導(dǎo)DNA的結(jié)合），與已知的POZ鋅指蛋白BCL6和PLZF有30-40％的同源性[1]。利用ZBTB20基因特異性敲除小鼠模型，本實(shí)驗(yàn)室揭示了ZBTB20基因在個(gè)體發(fā)育、物質(zhì)代謝和神經(jīng)調(diào)控等方面有重要的生理功能[2-6]。盡管如此，關(guān)于ZBTB20的生物學(xué)功能、其調(diào)控的下游靶基因以及介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有許多未明之處。
　　重組腺病毒是非整合型雙鏈DNA病毒，因而無(wú)插入突變，無(wú)致癌性，它具有感染分裂期和非分裂期細(xì)胞的能力

3、，且易于構(gòu)建、濃縮和純化，出毒率較高。我們前期的研究提示ZBTB20在肝臟物質(zhì)代謝、肝癌的發(fā)展中具有重要作用，因此具有肝臟靶向性的腺病毒表達(dá)載體無(wú)疑是我們進(jìn)一步研究ZBTB20在肝臟的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制的首選工具，于是我們構(gòu)建了ZBTB20的過(guò)表達(dá)腺病毒和干擾腺病毒兩種重組腺病毒，以便從正反兩方面進(jìn)行ZBTB20的生理和病理功能的研究。
　　我們將帶有FLAG標(biāo)簽的ZBTB20的cDNA片段（ZBTB20-FLAG）克隆至pA

4、dTrack-CMV載體，并轉(zhuǎn)化至細(xì)菌內(nèi)，使該重組載體與AdEasy質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，從而獲得重組腺病毒載體Ad-ZBTB20。之后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，并進(jìn)行三輪擴(kuò)增，經(jīng)濃縮純化后檢測(cè)病毒滴度。我們利用ZBTB20肝臟特異性敲除小鼠的原代肝細(xì)胞和肝臟組織模型，于離體和在體兩個(gè)水平鑒定所制備的重組腺病毒Ad-ZBTB20介導(dǎo)的ZBTB20 RNA和蛋白的表達(dá)情況;并利用報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)的ZBTB20蛋白的功能活性。另一方面我們將

5、CMV-ZBTB20shRNA片段克隆至pAdTrack-CMV載體，同樣將該重組載體與AdEasy質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，從而獲得重組腺病毒載體Ad-ZBTB20 shRNA。之后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，并進(jìn)行三輪擴(kuò)增，經(jīng)濃縮純化后檢測(cè)病毒滴度。我們采用ZBTB20正常表達(dá)小鼠的原代肝細(xì)胞和肝臟組織模型，于離體和在體兩個(gè)水平鑒定所制備的重組腺病毒Ad-ZBTB20shRNA對(duì)內(nèi)源性ZBTB20 RNA和蛋白的干擾效果。
　　最后