TIEG1誘導白血病細胞凋亡的相關研究.pdf

1、目的：
　　TIEG1是TGF-β1誘導的早期反應基因(TGF-β1 inducible early gene，TIEG1)，作為一個轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)多種與細胞生長分化有關的基因的表達。TIEG1的生物學功能仍未完全闡明，目前的研究認為TIEG1主要的生物學功能是抑制細胞增殖、誘導凋亡。TIEG1的這一功能主要與TGF-β/Smad信號通路有關。
　　Smads蛋白家族是一個在脊椎動物、昆蟲和線蟲內(nèi)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子家族，它是

2、迄今為止唯一已被證明的TGF-β受體作用的底物。在哺乳動物中，發(fā)揮主要作用的Smads蛋白是Smad2、Smad3、Smad4和Smad7。
　　Bcl-2家族基因廣泛分布于生物體中。據(jù)其在細胞凋亡調(diào)控中的不同作用，Bcl-2蛋白家族分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。Bcl-2與Bax基因均屬于Bcl-2家族，它們分別是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡基因，在腫瘤細胞凋亡中具有重要的調(diào)控作用。
　　TIEG1過表達可

3、抑制細胞增殖、誘導凋亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TIEG1異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，在惡性腫瘤組織中TIEG1的表達降低，如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等。這些研究結(jié)果表明，TIEG1可能是一個重要的腫瘤抑制因子，TIEG1過表達可抑制細胞增殖、誘導凋亡，因此有必要對其進行深入研究。
　　目前，TIEG1對血液腫瘤細胞的相關研究少見。有研究表明，在某些抗癌藥物誘導白血病細胞凋亡過程中，TIEG1的表達明顯上調(diào)。說明TIEG1可能是白血病

4、細胞的抑制因子，與白血病細胞的凋亡相關。
　　本研究通過探討TIEG1對白血病細胞的誘導凋亡作用，期望明確TIEG1誘導白血病細胞凋亡的分子機制，為白血病的治療尋找新靶點。
　　方法：
　　1、K562、Raji、U937、HL-60細胞株培養(yǎng)。
　　2、TIEG1以0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml濃度分別作用于白血病細胞，MTT法檢測細胞加藥后0h、6h、12h、24h、

5、48h的增殖抑制率。
　　3、選擇siRNA片段及作用時間，轉(zhuǎn)染HL-60細胞，沉默TIEG1表達。
　　4、流式細胞儀測定加藥后0h、6h、12h、24h、48h的細胞凋亡率。
　　5、RT-PCR檢測加藥后0h、6h、12h、24h、48h各時間點Smad2、Smad3、Smad4和Smad7及Bcl-2、Bax的RNA水平。
　　6、建立HL-60白血病小鼠模型:分為A、B、C、D4組，A組為對照組，B、C

6、、D組小鼠尾靜脈注射HL-60細胞。建模后每天觀察小鼠狀態(tài)，每周取小鼠尾靜脈外周血涂片觀察白細胞數(shù)量及形態(tài)。對HL-60白血病小鼠模型進行藥物處理:A、B組小鼠經(jīng)尾靜脈注射等體積生理鹽水，C組小鼠經(jīng)尾靜脈注射TIEG1（25ug/kg/d，每天1次，共注射14天），D組小鼠經(jīng)尾靜脈注射TIEG1（100ug/kg/d，每天1次，共注射14天）。14天后，處死各組小鼠，分離雙側(cè)股骨，留取骨髓細胞，完成后續(xù)實驗。
　　7、提取動物模型

7、各組細胞，以Western blot方法檢測Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bcl-2、Bax表達的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1、TIEG1對K562 Raji、U937白血病細胞具有增殖抑制作用，其抑制效應呈時間及劑量依賴性(P＜0.05)。以10ng/ml的TIEG1作用于K562、Raji、U937白血病細胞?？梢杂^察到各組白血病細胞在6h、12h、24h、48h均出現(xiàn)不同程度的凋亡，呈時間依賴性。<

8、br>　　2、TIEG1對HL-60細胞具有增殖抑制作用，其抑制效應呈時間及劑量依賴性(P＜0.05)。求得IC50:71.321ng/ml(6h),54.77ng/ml(12h),12.03ng/ml(24h)，8.45ng/ml(48h)。以12.03ng/ml的TIEG1作用于HL-60細胞，可以觀察到細胞在6h、12h、24h、48h均出現(xiàn)不同程度的凋亡，呈時間依賴性。以12.03ng/ml的TIEG1作用于HL-60細胞，分別

9、檢測用藥后0h、6h、12h、24h、48h各時間點，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7及Bax表達呈升高趨勢，而Bcl-2呈下降趨勢。
　　3、選定干擾片段轉(zhuǎn)染HL-60細胞，干擾TIEG1表達后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率較對照組、陰性組明顯下降。干擾TIEG1表達后，RT-PCR檢測Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bax的表達較對照組、陰性組下降，而Bcl-2表達升高。
　　4、動物模型外周血

10、涂片顯示用藥組比對照組原始細胞減少。Western blot檢測顯示對動物模型給予TIEG1后，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bax的表達較對照組升高，而Bcl-2表達下降。RT-PCR檢測檢測顯示對動物模型給藥后，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bax的表達較對照組升高，而Bcl-2表達下降。
　　結(jié)論：
　　1、TIEG1對K562、 Raji、U937、HL-60白血病細胞具有增殖抑制