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文檔簡介
1、目的:Toll 樣受體(TLR)是參與非特異性免疫的一類重要分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。新近研究發(fā)現(xiàn),許多微生物組分的抗癌免疫療效是通過TLR信號通路介導(dǎo)的。本實驗通過活化TLR4誘導(dǎo)單核細(xì)胞性白血病 THP-1細(xì)胞發(fā)生凋亡,并以此為切入點研究活化TLR4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制,為選擇TLR作為靶點治療單核細(xì)胞性白血病提供理論依據(jù)。 方法: (1)RT-PCR檢測基因的表達(dá)。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)。(
2、3)ELISA檢測分泌蛋白的表達(dá)。(4)PI-Annexin V染色檢測凋亡水平。(5)抗體中和實驗驗證細(xì)胞因子與 THP-1細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。(6)Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子的活化。 結(jié)果: RT-PCR結(jié)果顯示 THP-1細(xì)胞表達(dá)除TLR3以外所有的TLRs,進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)分析證實 THP-1細(xì)胞表面表達(dá)CD14、TLR2、TLR4蛋白,TLR4的配體12S刺激后,CD14、TLR2、TLR4的表達(dá)上調(diào)
3、,同時LPS也能活化TLR4信號傳導(dǎo)通路包括ERK、JNK、P38和NF-kB,說明THP-1細(xì)胞表達(dá)功能性TLR4。PI-Annexin V染色分析發(fā)現(xiàn)LPS活化TLR4誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的凋亡,并呈劑量依耐性和時間依耐性。LPS所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與上調(diào)凋亡相關(guān)細(xì)胞因子TNF α和TRAIL有關(guān),TNFα、TRAIL中和抗體阻斷因子的作用后,凋亡水平有一定的下降。另外,LPS還下調(diào)了Bcl-2的表達(dá),同時上調(diào)BAK的表達(dá)。Western
4、 Blot分析也發(fā)現(xiàn)LPS不僅誘導(dǎo)了Caspase 8的活化,同時也誘導(dǎo)了Caspase9的活化。因此,TLR4不僅通過受體凋亡途徑同時通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。此外,LPS活化TLR4還下調(diào)了Caspase 8抑制蛋白FLIPL的表達(dá),從而更有利于凋亡的發(fā)生。 結(jié)論:LPS通過活化TLR4誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞發(fā)生凋亡,此凋亡過程既有死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路參與又有線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路參與。LPS活化TLR
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