福氏志賀氏菌耐藥相關(guān)基因的克隆、表達及蛋白純化與結(jié)晶的初步研究.pdf

1、在細菌耐藥研究中有關(guān)細菌主動外排泵的研究是相對活躍的領(lǐng)域。外排泵是微生物對藥物和其他外來物質(zhì)產(chǎn)生耐藥性的一個重要機制，其中acrAB-to1C是一種常見的外輸泵，是由藥物外輸?shù)鞍譇crA、 AcrB和調(diào)節(jié)蛋白MarA調(diào)控作用來完成的。 本研究對福氏志賀菌多藥耐藥相關(guān)基因marA、aerA和acrB的克隆、蛋白表達、純化及結(jié)晶進行研究。根據(jù)已有數(shù)據(jù)，設(shè)計marA、aerA和aerB基因引物，提取基因組DNA并通過PCR擴增目的基因

2、，構(gòu)建克隆載體后，分別將目的基因片段通過BamH I和Sal I酶切位點插入表達載體pET-30a。經(jīng)酶切鑒定及序列測定表明，目的基因片段連接正確，按正確的讀碼框插入表達載體中，其核苷酸序列與報道的marA和acrA基因的同源性為100％，acrB基因同源性為99.7％。重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLys，37℃誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測表明，marA和aerA基因成功地在大腸埃希氏菌中得到了表達，表達蛋白的大小分

3、別約為21kDa和45kDa。通過可溶性分析得知acrA為可溶性表達蛋白，marA以包涵體形式表達。利用高濃度尿素裂解包涵體，采用稀釋法和氧化型、還原型谷胱甘肽系統(tǒng)相結(jié)合方法對marA蛋白進行復(fù)性。用金屬鰲合親合層析的方法對表達的marA和acrA蛋白進行純化和濃縮純化蛋白，測定表達蛋白的濃度為5 mg/mL，試驗獲得了能夠結(jié)晶的高濃度蛋白。 采用懸吊液滴蒸汽擴散法，對蛋白結(jié)晶條件進行篩選。觀察發(fā)現(xiàn)，在多種結(jié)晶條件下出現(xiàn)了晶體，