腦膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A基因的克隆和表達(dá).pdf

1、前言腦膜炎奈瑟氏菌是引起人流行性腦膜腦炎(以下簡(jiǎn)稱流腦)的致病菌。在非流行期，發(fā)病率在1-3/10萬(wàn)左右，而在流行期，發(fā)病可高達(dá)500/10萬(wàn)，對(duì)6個(gè)月到2歲的嬰幼兒及青少年危害極大，病死率高達(dá)10％以上，近年來(lái)，我國(guó)流腦發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，暴發(fā)流行時(shí)有發(fā)生，對(duì)我國(guó)人民的生命健康構(gòu)成極大威脅。 腦膜炎奈瑟氏菌根據(jù)菌體表面的莢膜多糖分為12個(gè)血清群。全世界大約90％的病人是由A群、B群和C群引起的。以A群、C群莢膜多糖為基礎(chǔ)的疫

2、苗被開發(fā)出來(lái)并被證明對(duì)控制流腦的暴發(fā)和流行有效。但是A群、C群疫苗對(duì)幼兒缺乏免疫原性，而且它們提供的保護(hù)期相對(duì)短，一般為1-3年。B群莢膜多糖由于無(wú)法誘導(dǎo)人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所以B群流腦疫苗一直也沒有被開發(fā)出來(lái)?；谶@些原因，開發(fā)非莢膜多糖的表面蛋白抗原疫苗以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性、持久性抗體就成為另一種選擇。 但是每個(gè)血清群的腦膜炎奈瑟氏菌根據(jù)菌體主要表面蛋白(OMP)又可分為多個(gè)血清型、血清亞型，如B群有20多個(gè)血清型，每個(gè)血清型

3、又有至少10多個(gè)血清亞型，依此類推12個(gè)血清群的腦膜炎奈瑟氏菌有上千種表面蛋白。尋找所有血清群共有的表面蛋白抗原成為幾十年來(lái)全世界腦膜炎奈瑟氏菌研究者奮斗的目標(biāo)，1997年Martin等發(fā)現(xiàn)了一種極為保守的表面蛋白，存在于所有的腦膜炎奈瑟氏菌菌體表面，命名為腦膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A(NspA)，含174個(gè)氨基酸，由525個(gè)核苷酸序列編碼組成。盡管Ns-pA的功能至今還不清楚，但給小鼠注射純化的或重組的NspA后都能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，抵

4、抗腦膜炎奈瑟氏菌的攻擊。 綜上所述，NspA對(duì)流腦的診斷和預(yù)防策略的制定具有極大的應(yīng)用價(jià)值。為此，本研究對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并采用ELISA對(duì)純化的NspA融合蛋白進(jìn)行了活性檢測(cè)，同時(shí)驗(yàn)證了人體可產(chǎn)生抗NspA蛋白的保護(hù)性抗體。 實(shí)驗(yàn)材料與方法刮取培養(yǎng)基上B群腦膜炎奈瑟氏菌，重懸于400μl的ddH20中，100℃10分鐘煮沸后，13000g離心10分鐘，取上清為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增

5、反應(yīng)體系：ddH2034μl，10×buffer5μl，dNTP4μl，引物P11μ1，引物P21μl，模板4μl，PyrobestDNA聚合酶1μl。反應(yīng)條件：94℃2min；94℃1min，60℃1min，72℃2min30個(gè)循環(huán)；72℃7min，4℃恒溫。PCR產(chǎn)物與pGEX-5X-3Vector分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后依回收試劑盒說(shuō)明書完成回收。用T4DNALigase連接PCR與pGEX-5X-3Vector的回收產(chǎn)物。

6、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21，提取pGEX-5X-3(+)NspA進(jìn)行雙酶切鑒定并對(duì)NspA基因序列進(jìn)行測(cè)序。 挑取陽(yáng)性克隆過(guò)夜培養(yǎng)，以1％接種量接種到100mlLB培養(yǎng)基中，30℃225rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加IPTG至終濃度0.25mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。取菌液6000rpm4℃離心10min，收集菌體。純化操作參照GSTrapFF說(shuō)明書進(jìn)行。SDS-PAGE及凝膠灰度掃描測(cè)定蛋白純度，Brad

7、ford法測(cè)定蛋白濃度。 ELISA檢測(cè)NspA活性：用50mmol/L碳酸鹽包被液稀釋純化的NspA，使其終濃度為4μg/ml，接種于96孔板，100μl/孔，室溫18h后，用含0.02％吐溫20的PBS洗4次，0.1％BSA200μl37℃封閉30min，用含0.02％吐溫20的PBS洗后，每孔加患者血清100μl，患者血清從1：10到1：1280共設(shè)8個(gè)稀釋度，同時(shí)設(shè)健康人血清陰性對(duì)照和空白對(duì)照。37℃孵育1h，PBS洗4

8、次后，每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體100μ1，37℃孵育1h，PBS洗4次后，加入OPD底物顯色，37℃孵育15min后加入終止液1NH2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀取492nmOD值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以B群腦膜炎奈瑟氏菌的DNA為模板，PCR擴(kuò)增后電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在500bp附近，與實(shí)際值相符。用BamHI和EcoRI對(duì)pGEX-5X-3(+)NspA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳顯示酶切產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度與實(shí)際值相符。

9、NspA基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)NspA基因全長(zhǎng)525bp，編碼174個(gè)氨基酸，與Genbank中相關(guān)序列比較，無(wú)新的突變位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)，在加入IPTG后1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)分別取菌液進(jìn)行鑒定，最后確定最佳表達(dá)時(shí)間為2小時(shí)。用GSTrapFF進(jìn)行純化，SDS-PAGE顯示NspA(與GST)融合蛋白分子量44KD。通過(guò)ELISA對(duì)10份確診流腦患者的恢復(fù)期血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在所有患者血清中均檢測(cè)到抗NspA抗體的存在

10、，且稀釋度都在1：20以上，表明該融合蛋白具有生物活性。 討論自1997年NspA基因被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，許多研究者都對(duì)其進(jìn)行了研究。有研究者用表達(dá)純化的NspA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，9周后再用致死劑量腦膜炎奈瑟氏菌對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊，結(jié)果72小時(shí)內(nèi)80％小鼠都存活下來(lái)，且在接下來(lái)兩個(gè)月的觀察期內(nèi)無(wú)一死亡，證明NspA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體是保護(hù)性抗體。但到目前為止，所有試驗(yàn)結(jié)果都是在動(dòng)物身上取得的，尚無(wú)研究者證明NspA也能誘導(dǎo)人產(chǎn)生保護(hù)性抗體。

11、 本研究成功構(gòu)建了NspA表達(dá)載體并純化出NspA融合蛋白。檢測(cè)顯示流腦患者的恢復(fù)期血清中都檢測(cè)到抗NspA抗體，且稀釋度都在1：20以上，這不但表明本研究所表達(dá)純化的NspA融合蛋白具有生物活性，更重要的是表明人在自然感染條件下，能產(chǎn)生抗NspA的抗體，為NspA將來(lái)發(fā)展成為亞單位蛋白疫苗提供了清晰明確的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 此外，用NspA融合蛋白包被酶標(biāo)板做成ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)人群抗體水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)制定準(zhǔn)確有效的流腦預(yù)防