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文檔簡(jiǎn)介
1、志賀氏菌屬(ShigellaSpp.)是引起人類細(xì)菌性痢疾的病原菌,通過Ⅲ型系統(tǒng)分泌蛋白至人類細(xì)胞中,導(dǎo)致炎癥應(yīng)答。痢疾是一種世界范圍內(nèi)高發(fā)病率的腸道傳染病,據(jù)保守估計(jì),每年導(dǎo)致全世界死亡人數(shù)超過一百萬例。
目前痢疾的主要治療方式是抗生素療法,并導(dǎo)致高達(dá)95%的臨床分離株對(duì)多種抗生素有耐藥性??股貫E用引起的細(xì)菌抗藥性已成為治療痢疾感染的難題。最近,在空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)中發(fā)現(xiàn)了首個(gè)細(xì)菌N
2、-糖基化(N-glycosylation)途徑,其中該途徑關(guān)鍵酶PglB的發(fā)現(xiàn),對(duì)糖蛋白疫苗的研發(fā)具有里程碑式意義。
細(xì)菌N-糖基化途徑與脂多糖合成相似,均在脂載體上合成寡糖鏈前體,寡糖鏈前體經(jīng)翻轉(zhuǎn)至周質(zhì)空間后,或者由寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB轉(zhuǎn)移到其蛋白底物上,或者先經(jīng)多聚化為O-PS后,再被O-抗原連接酶WaaL連接到類脂A-核心寡糖上形成LPS。利用兩種途徑的相似性:若缺失催化dTDP-鼠李糖合成的基因rfbA,將可以聚合
3、形成O-PS的寡糖鏈前體破壞,蛋白有可能受影響而不能被糖基化;若將O-PS來代替C.jejuni中的七糖前體,將寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB和其蛋白底物克隆到O-抗原連接酶WaaL失活的菌中,即可能獲得連接有O-PS的N-連接糖蛋白。本研究利用兩途徑的相似性對(duì)探究志賀氏菌內(nèi)潛在糖蛋白和獲得針對(duì)志賀氏菌的糖.蛋白綴合物疫苗兩方面展開研究。
在本文中,采用改進(jìn)的λ-Red重組系統(tǒng),成功構(gòu)建了福式2a志賀氏菌301waaI缺失突變株和r
4、fbA缺失突變株,同時(shí)利用低拷貝質(zhì)粒成功構(gòu)建了waaI回復(fù)株。對(duì)這三個(gè)菌株和野生株進(jìn)行LPS銀染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表型鑒定,發(fā)現(xiàn)缺失waaI和rfbA,均影響了LPS合成,在凝膠中未形成一長(zhǎng)串的梯狀條帶。接著,對(duì)所構(gòu)建的菌株進(jìn)行生理生化特征研究,并進(jìn)行豚鼠角膜實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)毒力。結(jié)果表明:waaI和rfbA的缺失對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響不大;相比于野生株,waaI突變株利用棉子糖的能力降低。在豚鼠角膜實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)waaI和rfbA的缺失株均不能合成LPS,而
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