福氏2a志賀氏菌waaI和rfbA功能的研究.pdf

1、志賀氏菌屬(ShigellaSpp.)是引起人類細菌性痢疾的病原菌,通過Ⅲ型系統(tǒng)分泌蛋白至人類細胞中,導致炎癥應答。痢疾是一種世界范圍內(nèi)高發(fā)病率的腸道傳染病,據(jù)保守估計,每年導致全世界死亡人數(shù)超過一百萬例。
　　 目前痢疾的主要治療方式是抗生素療法,并導致高達95％的臨床分離株對多種抗生素有耐藥性?？股貫E用引起的細菌抗藥性已成為治療痢疾感染的難題。最近,在空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)中發(fā)現(xiàn)了首個細菌N

2、-糖基化(N-glycosylation)途徑,其中該途徑關鍵酶PglB的發(fā)現(xiàn),對糖蛋白疫苗的研發(fā)具有里程碑式意義。
　　 細菌N-糖基化途徑與脂多糖合成相似,均在脂載體上合成寡糖鏈前體,寡糖鏈前體經(jīng)翻轉(zhuǎn)至周質(zhì)空間后,或者由寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB轉(zhuǎn)移到其蛋白底物上,或者先經(jīng)多聚化為O-PS后,再被O-抗原連接酶WaaL連接到類脂A-核心寡糖上形成LPS。利用兩種途徑的相似性:若缺失催化dTDP-鼠李糖合成的基因rfbA,將可以聚合

3、形成O-PS的寡糖鏈前體破壞,蛋白有可能受影響而不能被糖基化;若將O-PS來代替C.jejuni中的七糖前體,將寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB和其蛋白底物克隆到O-抗原連接酶WaaL失活的菌中,即可能獲得連接有O-PS的N-連接糖蛋白。本研究利用兩途徑的相似性對探究志賀氏菌內(nèi)潛在糖蛋白和獲得針對志賀氏菌的糖.蛋白綴合物疫苗兩方面展開研究。
　　 在本文中,采用改進的λ-Red重組系統(tǒng),成功構(gòu)建了福式2a志賀氏菌301waaI缺失突變株和r

4、fbA缺失突變株,同時利用低拷貝質(zhì)粒成功構(gòu)建了waaI回復株。對這三個菌株和野生株進行LPS銀染實驗進行表型鑒定,發(fā)現(xiàn)缺失waaI和rfbA,均影響了LPS合成,在凝膠中未形成一長串的梯狀條帶。接著,對所構(gòu)建的菌株進行生理生化特征研究,并進行豚鼠角膜實驗來檢測毒力。結(jié)果表明:waaI和rfbA的缺失對菌體的生長影響不大;相比于野生株,waaI突變株利用棉子糖的能力降低。在豚鼠角膜實驗中,發(fā)現(xiàn)waaI和rfbA的缺失株均不能合成LPS,而