HCV全基因組復制子的構建及HCV6型患者PEG-IFN療效分析.pdf

1、本文分兩個部分進行探討。
　　第一部分 構建雙核酶自切割HCV JFH1復制子并研究其體內外復制特性
　　目的：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)基因組長度為9.6kbp，是正鏈RNA病毒，其基因組由編碼區(qū)、非編碼區(qū)兩部分構成。編碼區(qū)包含:核心蛋白區(qū)、包膜蛋白區(qū)、P7蛋白區(qū)、非結構區(qū);非編碼區(qū)是由5'與3'非編碼區(qū)組成。HCV是導致慢性丙型肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原體，目前已有越來越多的人受到該病毒

2、的困擾，但迄今為止依然沒有對應有效的疫苗。根據世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，目前全世界范圍內共有1.8億慢性丙型肝炎患者，HCV防治已經成為我國乃至全球的最主要公共衛(wèi)生問題。
　　本研究基于JFH1 cDNA序列，建立了雙核酶自切割HCV全基因組復制子，該復制子可在細胞內直接啟動HCV復制，并包裝出具有感染性的病毒顆粒，病毒進行復制、包裝、釋放、重新感染的過程，保持了培養(yǎng)系統(tǒng)里HCV長時間穩(wěn)定和高效率的復制，模擬了HCV完整的生命周期循環(huán)，

3、可用于HCV生物學特性研究及抗HCV藥物長期的觀察和篩選。并且該復制子也可進行動物模型的研究。
　　方法：1.在HCV JFH1及HCV JFH1/GND的cDNA序列兩側分別利用PCR基因重組技術加上核酶序列，分別與真核表達載體pcDNA3.1進行基因重組，構建含雙核酶自切割序列HCV JFH1全基因組復制子，即重組質粒pcDNA3.1-RZ-JFH1和其陰性突變株pcDNA3.1-RZ-JFH1/GND。
　　2.我們把

4、構建的復制子化學轉染進Huh7.5細胞、通過尾靜脈高壓注射進行昆明小鼠的實驗。觀察細胞培養(yǎng)上清HCV RNA、小鼠血清HCV RNA水平;細胞免疫熒光、免疫組化學染色和相關的血清學檢查分別測試該復制子的體內和體外復制的特點。
　　結果：1.雙核酶自切割HCV JFH1全基因組復制子構建成功:重組質粒pcDNA3.1-RZ-JFH1及pcDNA3.1-RZ-JFH1/GND，經EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鑒定，酶切條帶大小均與預期一致，

5、重組質粒構建成功。
　　2.在16周的檢測期內，從轉染pcDNA3.1-RZ-JFH1復制子的Huh7.5培養(yǎng)液中長時間平穩(wěn)的檢測出HCV RNA，其拷貝數(shù)可達到1×106～3×106/ml。pcDNA3.1-RZ-JFH1/GND細胞培養(yǎng)上清中的HCV RNA水平一直低于檢測下限。
　　3.復制子pcDNA3.1-RZ-JFH1轉染組細胞中出現(xiàn)HCV核心抗原染色陽性細胞約占20％; HCV感染組細胞中出現(xiàn)HCV核心抗原染色

6、陽性的細胞約占5％。復制系統(tǒng)里包裝出的的病毒顆粒有感染性，可以感染新的Huh7.5細胞。
　　4.短期的病毒血癥在尾靜脈高壓注射了HCV JFH1復制子的昆明小鼠中被檢出，隨后進行的其肝臟免疫組化染色中，HCV抗原陽性細胞未被觀察到，同時小鼠血清中也未能檢測到HCV抗體。
　　結論：本研究建立的HCV JFH1全長復制子可以在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內長時間、平穩(wěn)、高效地包裝出具有感染性的HCV病毒顆粒，但在體內實驗中，未能取得理想效果

7、;可能是HCV JFH1病毒株來源的特殊性導致了這種結果。本實驗構建的HCVJFH1全長基因組復制子了，在HCV生物學特性研究和抗HCV藥物測試等方面可以起到很大的作用。
　　第二部分 聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療HCV6型感染者的臨床療效回顧性分析
　　目的：研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇干擾素(pegylated interferon，PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin，RBV)治療HCV，已經成為臨床醫(yī)生的共識，但

8、是療效上卻取決于HCV感染的基因型，不同的基因型所取得的持續(xù)性病毒學應答(sustainedvirological response，SVR)率有明顯差異，有研究提示HCV1型最低，只有40-50％左右，HCV2/3型可達到70-80％，甚至可以更高。HCV共有6個基因型，其中1型、2型和3型呈全世界分布，而4型、5型主要分布在非洲，6型主要流行于亞洲。由于世界經濟及醫(yī)療衛(wèi)生的格局，HCV4型、5型、6型的研究甚少，主要的研究集中在HC

9、V1型、2/3型。
　　近年來，我國醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，HCV的傳播方式發(fā)生了改變，輸血和使用血液制品導致的HCV感染已經明顯下降，隨之而來的是靜脈吸毒導致的HCV感染比例明顯提高。由于靜脈吸毒史是導致HCV6型感染的主要原因，所以我們國家的HCV6型感染者比例呈上升趨勢，有研究表明，這種趨勢尤其以我國西南地區(qū)為甚，這可能與我國西南地區(qū)毗鄰東南亞全球毒品主要生產地之一的緣故。HCV6型感染者的比例不斷升高，對我們的臨床治療提出了規(guī)

10、范化要求。目前HCV1型和2/3型感染者臨床上均有標準的治療方案，但HCV6型感染者的治療方式及療程還需進一步探討、商榷并確定。曾經有報道分析HCV1型、2/3型、6型病例的PEG-IFN聯(lián)合RBV抗病毒治療效果，研究發(fā)現(xiàn)，HCV1型治療效果最差，而HCV6型病例治療效果明顯好于HCV1型，但是和HCV2/3型病例的抗病毒療效無明顯差異。另外有研究將HCV6型分別應用了24w和48w的PEG-IFN聯(lián)合RBV的病例入組，比較兩者在治療時

11、間上抗病毒效果的差異，最后發(fā)現(xiàn)兩者的療效沒有統(tǒng)計學的差異。由于目前有大量的報道都認為HCV6型病例應用PEG-IFN聯(lián)合RBV治療24w取得的效果可以達到HCV2/3型同樣治療方案的水平。
　　本研究在重慶第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院感染科的所有門診和住院的病人中，收集了2010年5月-2014年10月應用PEG-IFN聯(lián)合RBV治療的HCV6型、2/3型感染者的詳細病例資料進行回顧性分析，經過嚴格的入組篩選過程，我們最終入組了137例病

12、人。HCV6型患者53例，HCV2/3型患者84例。通過比較基線資料，各個時間點的病毒應答情況來比較兩組間療效的差別，用來對臨床工作作出指導。
　　方法：收集重慶西南醫(yī)院感染病?？漆t(yī)院2010年5月至2014年10月所有門診和住院期間應用PEG-IFN聯(lián)合RBV治療的HCV6型感染者和2/3型感染者的臨床資料（年齡、性別、HCV RNA水平、ALT水平、腹部彩超結果、感染途徑、治療過程），進行病例入組，所有納入病例符合以下納入條件

13、:(1)利巴韋林每日用量針對體重＜65kg、65-85kg、＞85kg的病人分別為800mg、1000mg、1200mg;派羅欣皮下注射180μg/周;佩樂能每周皮下注射1.5μg/kg;(2)治療時間大于等于24周，小于等于26周。并且有6個月以上隨訪完整資料;(3)排除HBV、HIV、糖尿病、高血壓、自身免疫性肝病等疾病。將患者分為HCV6型與2/3型感染者兩組，分別對兩組患者的RVR、EVR、SVR進行比較。采用SPSS18.0軟

14、件進行分析，計量資料以平均值±標準差（x±s）的方式標出。t檢驗被應用到對基線計量資料的比較中;率的比較采用x2檢驗;對感染者基線資料與最終抗病毒療效的影響，采用多因素Logistic回歸分析;對療效評價采用非劣效檢驗，即當試驗組非劣于對照組時，認為試驗成功。經臨床專家商討，非劣效性界值△=15％，P＜0.05作為統(tǒng)計學檢驗水準。
　　結果：1.HCV6型與2/3型感染者年齡及性別分布、治療前血清HCV RNA與ALT水平以及應用

15、PEG-IFN種類均無統(tǒng)計學差異。但吸毒史在HCV6型感染者中的比例高于HCV2/3型感染者所占的比例(P=0.001)。
　　2.HCV6型、2/3型感染者獲得RVR比例分別是88.7％、89.3％，率差95％可信區(qū)間為:（-0.1139，0.1019）;獲得EVR的比例分別是94.3％、96.4％，率差95％可信區(qū)間為:（-0.0950，0.0530）;獲得SVR的比例分別是86.8％、90.5％，率差95％可信區(qū)間為:（-0

16、.1476，0.0736）;HCV6型、2/3型感染者RVR對SVR的陽性預測值分別為89.4％、93.3％，率差95％可信區(qū)間為:(-0.1436，0.0656);EVR對SVR的陽性預測值分別為88.0％、91.4％，率差95％可信區(qū)間為:(-0.1428，0.0748)。上述指標的率差95％可信區(qū)間下限均小于非劣效性界值0.15，非劣效性檢驗成立，可以認為在上述各項指標的比較中，HCV6型感染者非劣于HCV2/3型感染者。