中國人HCV標(biāo)本庫的建立及全長基因組質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、背景和目的：丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)是丙型肝炎的致病體，丙型肝炎是世界范圍內(nèi)的重要傳染病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，目前全世界約有1億8千萬HCV感染者，其中85％發(fā)展成慢性丙型肝炎，在10～20年中又有20％～50％進(jìn)展成肝硬化，1％～2％發(fā)展成肝細(xì)胞癌。目前干擾素聯(lián)合利巴韋林是治療HCV感染的唯一手段，但其療效有限，只有不到40％的患者有一定療效，且不同的HCV基因型別對于干擾素的持續(xù)性病毒應(yīng)答率亦不

2、同?？笻CV藥物開發(fā)的主要障礙在于缺乏高效的體外HCV復(fù)制細(xì)胞模型和小動(dòng)物模型。近年報(bào)道的選擇性雙順反子(cistron：編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的一個(gè)DNA單位)亞基因組HCVRNA復(fù)制子(replicon：基因組中一個(gè)能被獨(dú)立復(fù)制的DNA片段單位)系統(tǒng)為HCV致病機(jī)理研究及抗病毒藥物評價(jià)提供了一個(gè)新的途徑。盡管HCV亞基因組復(fù)制子模型對HCV致病機(jī)理研究及抗病毒藥物開發(fā)具有重要意義，但建立能產(chǎn)生完整病毒顆粒的HCV全基因組復(fù)制子對揭示HCV完

3、整的生活周期、病毒裝配，結(jié)構(gòu)蛋白對抗病毒藥物的影響等將具有更重要的實(shí)際意義。HCV基因組長約9.6kb，由于HCV基因組富含GC且具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，使得HCV全長基因組擴(kuò)增至今尚未獲得成功。然而HCV感染個(gè)體存在準(zhǔn)種現(xiàn)象，短片段擴(kuò)增、拼接構(gòu)建全長基因組，有可能將不同的病毒株(variants)片段拼接在一起，使得研究病毒基因變異、獲得感染性克隆和疫苗研制等工作缺乏更加準(zhǔn)確的平臺。因此采用長鏈RT-PCR方法用盡量少的片段，即盡可能長的

4、片段構(gòu)建HCV全長基因組將更有價(jià)值。本研究首先建立了HCV的標(biāo)本庫，并進(jìn)行了HCV基因型別的確定，為后續(xù)研究提供足夠數(shù)量的HCV標(biāo)本。然后以我國主要流行的HCV基因型感染者為研究對象，建立HCV長鏈RT-PCR方法，構(gòu)建HCV全長基因組質(zhì)粒。研究共分兩部分進(jìn)行：第一部分為中國人HCV感染系列標(biāo)本庫的建立，采集系列標(biāo)本，收集詳實(shí)的流行病學(xué)、臨床及實(shí)驗(yàn)室資料，旨在篩選出主要流行基因型的血清標(biāo)本，為HCV全長基因組的構(gòu)建提供材料；第二部分為建

5、立長鏈RT-PCR的方法，旨在構(gòu)建中國人HCV全長基因組質(zhì)粒，為中國人復(fù)制子的建立奠定基礎(chǔ)，將為HCV體外復(fù)制機(jī)理、細(xì)胞致病機(jī)理的研究及抗HCV藥物的開發(fā)和疫苗研制等提供一個(gè)新途徑。 方法： 1.對西南醫(yī)院傳染科門診和住院病人血抗HCV陽性者進(jìn)行基本的生化篩選及病毒學(xué)檢測，同時(shí)留取血液10-20ml，分離血清，-80℃保存。 2.采用專門軟件，對患者的流行病學(xué)資料、臨床與實(shí)驗(yàn)室資料進(jìn)行規(guī)范化管理。定期隨訪，系列收

6、集，不斷擴(kuò)充標(biāo)本庫。 3.以GenBank中所有HCV全長序列為參照序列，設(shè)計(jì)引物，通過RT-nestedPCR擴(kuò)增C基因的羧基端至E1基因的氨基端長度為474bp的片段，測定其核苷酸序列，與GenBank中已知的HCV序列進(jìn)行系譜分析，確定HCV基因型別。 4.HCV長鏈RT-PCR方法的建立，包括：模板提取方法的確定，引物設(shè)計(jì)及其功能驗(yàn)證，RT-PCR條件的優(yōu)化，高保真Taq酶和反應(yīng)體系的篩選等。 5.HCV

7、全長基因組質(zhì)粒的構(gòu)建，選擇重慶地區(qū)最常見的HCV基因型，且病毒載量高的標(biāo)本作為長鏈擴(kuò)增的材料，進(jìn)行全長RT然后分兩個(gè)片段5.2kb和4.4kb擴(kuò)增，5.2kb片段為HCV5'UTR的大部分羧基端至NS3的氨基端，4.4kb片段為NS3的羧基端至3'UTR。將兩片段長鏈PCR產(chǎn)物融合得到HCV全長基因組，TA克隆，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞獲得HCV全長基因組質(zhì)粒并驗(yàn)證。 結(jié)果： 1.中國人HCV標(biāo)本庫的建立，收集到152例患者，共1

8、73份血清標(biāo)本，所有標(biāo)本血抗HCV陽性，其中92例患者HCVRNA定量大于103copies/ml，同時(shí)錄入了患者完整的流行病學(xué)及臨床資料，并可提供研究所需的血清標(biāo)本。 2.92份抗HCV陽性，HCVRNA定量大于103copies/ml的感染者血清標(biāo)本進(jìn)行基因分型RT-nestedPCR檢測均獲得陽性條帶。序列與系譜分析顯示1b33例，占35.9％，2a13例，占14.1％，3a13例，占14.1％，3b14例，占15.2％，

9、6a19例，占20.7％，未見1a和2b型。 3.HCV長鏈RT-PCR方法的建立。模板采用Invitrogen公司的TrizolLSReagent提取得到的HCVRNA可保持完整性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3'UTR的polyU結(jié)構(gòu)未被破壞；設(shè)計(jì)的長鏈擴(kuò)增引物經(jīng)驗(yàn)證均能與模板匹配；RT反應(yīng)選用TOYOBO公司的FirstStrandcDNASynthesisKit，長鏈PCR采用TaKaLa公司的LATaq酶，反應(yīng)最佳的RT條件是42℃4

10、0min，然后99℃5min，4℃5min，PCR條件是94℃熱啟動(dòng)1min，然后94℃變性30sec、62℃退火30sec，72℃延伸4min30sec，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，可以獲得5.2kb和4.4kb的長鏈片段。 4.1例HCVRNA定量為3.657×106copies/ml的1b型患者血清經(jīng)長鏈RT-nestedPCR擴(kuò)增，凝膠電泳顯示，獲得5.2kb和4.4kb條帶，將兩片段融合后克隆獲得的HCV全長基因組質(zhì)粒經(jīng)電泳分析

11、和菌落PCR法驗(yàn)證，顯示HCV全長基因組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 結(jié)論： 1.該研究構(gòu)建了中國人HCV標(biāo)本庫，將為我國人群中HCV的致病機(jī)理、病毒進(jìn)化和機(jī)體因素及病毒相互作用的研究和最終的疫苗研制、藥物開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)；也將有利于國際間的合作。這將是我國進(jìn)行HCV研究的獨(dú)特的寶貴資源。 2.重慶地區(qū)HCV流行的基因亞型有1b、2a、3a、3b、6a五種，1b為流行的主要基因型，2a、3a、3b和6a型均占相當(dāng)比例，初步說

12、明重慶地區(qū)HCV流行的基因型呈現(xiàn)多樣性，并發(fā)現(xiàn)各基因亞型的主要傳播途徑有所側(cè)重，其中1b和2a型輸血傳播多見，3a、3b和6a型吸毒感染多見。 3.本研究建立了HCV的長鏈RT-nestedPCR方法，并成功構(gòu)建了HCV全長基因組質(zhì)粒，為研究病毒基因變異、獲得感染性克隆和疫苗研制等工作提供了更加準(zhǔn)確的平臺，為中國人復(fù)制子的建立奠定了基礎(chǔ)，也將為HCV體外復(fù)制機(jī)理、細(xì)胞致病機(jī)理的研究及抗HCV藥物的開發(fā)和疫苗研制等提供一個(gè)新途徑。