HCV基因分型生物芯片的研制及HCV基因型與自身免疫關(guān)系的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是血源性肝炎的主要病因，感染后極易慢性化，并與肝硬化和原發(fā)性肝癌的發(fā)生關(guān)系密切，對(duì)人類健康危害很大。HCV感染是我國目前一個(gè)嚴(yán)重的衛(wèi)生問題。HCV是單股正鏈線狀RNA病毒，由于缺乏復(fù)制酶校準(zhǔn)功能及易誤性RNA依賴性RNA多聚酶的存在，其基因組的主要特點(diǎn)為多態(tài)性和高度變異性。目前，世界范圍內(nèi)已經(jīng)克隆到的分離株可分為11個(gè)基因型(gerlotype)，其中又可以分為約90個(gè)亞型(su

2、btype)。HCV分型研究對(duì)HCV流行病學(xué)、進(jìn)化機(jī)制，診斷、療效預(yù)測(cè)、預(yù)后判斷等方面都有重要意義。HCV感染可引起機(jī)體免疫功能紊亂進(jìn)而引發(fā)機(jī)體自身免疫。基于分子模擬的理論，HCV感染導(dǎo)致自身免疫疾病中所出現(xiàn)的自身抗體的種類和數(shù)量，丙型肝炎的發(fā)生發(fā)展過程、預(yù)后、治療都有可能直接與所感染的HCV的型別有關(guān)。生物芯片技術(shù)由于同時(shí)將大量探針固定于支持物上，所以可以對(duì)樣品中的不同核酸序列進(jìn)行檢測(cè)和分析。商品化高精度自動(dòng)化微陣列點(diǎn)樣儀的出現(xiàn)，使得

3、規(guī)范化制作用于疾病診斷的芯片成為現(xiàn)實(shí)，借助具有卓越性能的激光共聚焦顯微掃拙技術(shù)可對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)和分析。 本文選擇先設(shè)計(jì)型特異性寡核苷酸探針，在玻璃基底上點(diǎn)樣固定，再與丙肝病人血清經(jīng)過熒光標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄套式-PCR后得到的HCV 5'UTR區(qū)cDNA片段雜交，用激光共聚焦掃描儀讀出雜交后的熒光信號(hào)，陣列模式(pattern)經(jīng)計(jì)算機(jī)識(shí)別給出分型的方法，進(jìn)行芯片上的HCV基因分型。在初步獲得分型結(jié)果后，同時(shí)檢測(cè)不同

4、基因型HCV感染患者血清中的自身抗體譜，試圖探討丙型肝炎病毒基因型與自身免疫關(guān)系，為臨床治療提供有價(jià)值的資料。 1.HCV基因分型生物芯片的設(shè)計(jì)。通過對(duì)國際公共生物信息數(shù)據(jù)庫Genbank的檢索和查找，以及生物信息處理軟件的綜合應(yīng)用，總結(jié)出了一套病毒基因分型的探針設(shè)計(jì)方法和過程。在認(rèn)識(shí)HCV基因組的高度變異性，基因組各組成的結(jié)構(gòu)和功能，了解HCV分型方法現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上提出了用5'UTR和C區(qū)聯(lián)合型特異性探針雜交生物芯片基因分型的方

5、法。在對(duì)世界各地克隆到的約125個(gè)有代表性的HCV分離株5'UTR核酸序列，以及約80個(gè)C區(qū)核酸序列做出分析后，根據(jù)生物芯片的探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)出一套共36顆HCV型特異性探針。芯片上的探針陣列雜交信號(hào)構(gòu)成了約33種模式(Pattern)，這些Pattern共約代表了25個(gè)HCV基因型和基因亞型。利用計(jì)算機(jī)的對(duì)Pattern的識(shí)別可以實(shí)現(xiàn)用生物芯片快速準(zhǔn)確地進(jìn)行大規(guī)模HCV基因分型診斷。 2.HCV基因分型生物芯片的制作。通過分

6、子自組裝和共價(jià)偶聯(lián)技術(shù)，成功制備了兩種可與寡核苷酸探針以共價(jià)鍵連接的生物芯片玻璃載體：APTES-GA修飾玻片和APTES-PDC修飾玻片。以AES和AFM加以表征，證明修飾成功。在激光共聚焦掃描儀ScanArray<'TM>Lite下檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)APTES-PDC修飾的玻片在Cy5熒光染料的激發(fā)光波長范圍內(nèi)具有更好的光學(xué)特性，熒光本底更低。用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀Cartesian PixSys<'TM> PA5500構(gòu)建了生物芯片探針陣列。獲得

7、了理想的探針固定密度約1分子/500nm<'2>。 3.HCV基因分型生物芯片檢測(cè)的建立和應(yīng)用。首次采用熒光逆轉(zhuǎn)錄套式PCR的方法，建立了HCV芯片探針雜交的靶序列-HCV5’ UTR cDNA的穩(wěn)定擴(kuò)增過程，并標(biāo)記上Cy5熒光分子。找到了成功擴(kuò)增同時(shí)用熒光染料均一標(biāo)記靶序列的較佳的Cy5熒光標(biāo)記物的摻入比。通過多次試驗(yàn)，綜合比較影響雜交的各種條件，建立了簡單但效果良好的芯片雜交體系和過程。初步建立了所制備的HCV基因分型芯片

8、在ScanArray<'TM> Lite激光共聚焦掃描儀下從檢測(cè)開始到出臨床檢測(cè)報(bào)告單的電子化過程。對(duì)21例南京市第二醫(yī)院初診HC住院患者的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得了良好的雜交信號(hào)和初步的分型診斷結(jié)果。 4.HCV基因型與自身免疫的關(guān)系。文中對(duì)21例南京市第二醫(yī)院初診HC住院患者的血清樣品進(jìn)行了自身抗體譜的測(cè)定，每份樣品共檢測(cè)了9種自身抗體，包括抗核抗體(ANA)、RE、ads-DNA、抗Sm、抗SSA、抗Jo-1、抗心磷脂抗體(