哈茨木霉生物防治相關(guān)蛋白酶的基因克隆及功能研究.pdf

1、哈茨木霉（Trichodermaharzianum）是重要的生物防治菌，能夠通過(guò)產(chǎn)生水解酶降解植物病原菌的細(xì)胞壁，抑制植物病原菌生長(zhǎng)，現(xiàn)已開(kāi)始應(yīng)用于植物病害的生物防治中。其水解酶的研究對(duì)充分發(fā)掘哈茨木霉（T.harzianum）的生防潛力有重要意義。以往關(guān)于哈茨木霉（T.harzianum）水解酶的研究多集中于幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，而關(guān)于蛋白酶的生物防治功能研究則少有報(bào)道。
　　本文以哈茨木霉（T.harzianum）菌

2、絲體時(shí)期誘導(dǎo)cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，利用SMARTRACE技術(shù)克隆了哈茨木霉（T.harzianum）枯草桿菌蛋白酶基因sl41、ss10及天冬氨酸蛋白酶基因sa76的cDNA序列及DNA序列。cDNA序列提交GenBank，序列號(hào)分別為DQ910533、EF063644和EF063645。通過(guò)生物信息學(xué)分析手段對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了哈茨木霉（T.harzianum）天冬氨酸蛋白酶asp83基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并登錄到GenBa

3、nk中，登錄號(hào)為EF063643。
　　采用Northernblot方法分析了哈茨木霉（T.harzianum）sl41、ss10、sa76和asp83基因在不同植物病原真菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)條件下和不同饑餓條件下的表達(dá)模式。結(jié)果表明盡管4條基因彼此之間表達(dá)模式有明顯差異（如啟動(dòng)表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度等），但是都能夠被植物病原菌細(xì)胞壁強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。5種病原真菌細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)均能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)sl41、ss10基因表達(dá)，且表達(dá)不受碳源和氮源的調(diào)

4、節(jié)。sa76基因能夠被病原菌細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)，而且表達(dá)受碳、氮饑餓調(diào)控。asp83基因表達(dá)受氮源的負(fù)調(diào)控，能夠被楊樹(shù)爛皮病菌（Cytosporachrysosperma）、立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）、核盤(pán)菌（Sclerotiniasclerotiorum）3種植物病原菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)表達(dá)。說(shuō)明這些基因可能在哈茨木霉（T.harzianum）生物防治過(guò)程中具有重要作用。
　　將克隆到的sl41、ss10、sa

5、76和asp83蛋白酶基因分別構(gòu)建到帶有高效啟動(dòng)子的釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）表達(dá)載體pYES2上，并成功轉(zhuǎn)入釀酒酵母（S.cerevisiae）H158菌株中。Northern雜交表明蛋白酶基因在釀酒酵母（S.cerevisiae）轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)出現(xiàn)單一條帶，大小與預(yù)期相符，表明蛋白酶成功分泌到胞外。
　　以酪蛋白為作用底物，通過(guò)福林法對(duì)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液中的蛋白酶進(jìn)行酶學(xué)特性研

6、究。枯草桿菌蛋白酶SL41和SS10酶促反應(yīng)的最適pH均為8.0，在pH7.5～9.5的范圍內(nèi)保持著較高的酶活；最適酶促反應(yīng)溫度分別為40℃和50℃，SL41在25～30℃范圍內(nèi)對(duì)溫度變化較敏感；最適酶促反應(yīng)條件下的酶活分別為19.4U/mL和17.8U/mL。天冬氨酸蛋白酶SA76和ASP83酶促反應(yīng)的最適pH分別為3.5和4.0，而且它們?cè)趐H3～5的范圍內(nèi)保持著較高的酶活；SA76和ASP83的最適酶促反應(yīng)溫度為分別為45℃和40

7、℃；最適酶促反應(yīng)條件下的酶活分別為11.8U/mL和4.0U/mL。
　　以5種常見(jiàn)的植物病原真菌，尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）、立枯絲核菌（R.solani）、核盤(pán)菌（S.sclerotiorum）、鏈格孢菌（Alternariaalternata）和楊樹(shù)爛皮病菌（C.chrysosperma）作為供試菌研究哈茨木霉4種離體蛋白酶的生物防治功能。結(jié)果表明：4種蛋白酶對(duì)5種常見(jiàn)植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出了不同程

8、度的抑制作用?？莶輻U菌蛋白酶SL41和SS10對(duì)5種病原真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，特別是對(duì)尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）的抑制效果最為明顯，菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為58.22％和47.38%。天冬氨酸蛋白酶ASP83對(duì)立枯絲核菌（R.solani）和楊樹(shù)爛皮病菌（C.chrysosperma）有抑制作用，對(duì)其余3種病原菌則幾乎無(wú)抑制作用。SA76對(duì)5種植物病原真菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，其中對(duì)尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）表現(xiàn)出明顯的